环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可行性的的研究的的报告.pdfVIP

环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制 可行性研究报告 李思光 李思光 李李思思光光 南昌大学 南昌大学 南南昌昌大大学学 一、选题的必要性 1、项目所处技术领域产业政策 本项目属生物高技术领域，是国家重点支持的研究领域，项目 主要针对严重影响人类健康的主要病原菌的检测与诊断需要进行检 测技术的研究与试剂盒的开发，本项目的实施可产生具有自主知识产 权的科研成果。本项目技术含量高，市场竞争力强，项目完成后能够 产生较好的经济效益和社会效益，项目符合国家产业、技术政策。 2、项目所处技术领域技术发展现状 目前的病原菌检测方法费时、费力、准确性低，开发快速、准 确、低成本的检测技术和配套试剂是病原菌检测工作中亟待攻克的难 题。本项目针对病原菌检测中存在的问题，采用高灵敏度、高特异性 的环介导等温扩增技术开发出简便、快速、经济的检测试剂。 3、项目技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用 环介导等温扩增是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性 的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。 该技术在1h内能扩增出10 靶序列拷贝。LAMP技术以其特异性强、9 灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的 诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。该技术的推广 对生物学、食品科学及医学领域中的检测和诊断技术的进步有推动作 用。 4、项目目前进展情况 课题组开展了大量前期研究工作，已完成了本项目所需的科研 平台建设任务，开展了嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温扩 增研究，取得了阶段性研究成果，这些工作为本项目的顺利完成奠定 了基础。 二、技术方案论述 （一）项目技术关键点和创新点，项目完成时达到的技 术水平 1、技术关键 （1）本项目的技术关键之一是引物设计。与常规PCR引物不同， 环介导等温扩增引物设计难度大，一组引物要求有6个位点与靶序列 完全匹配才能够进行扩增。目前我们已从国际基因组数据库中下载了 部分病原菌的基因组DNA，并根据基因组特点采用等温扩增软件设计 了部分引物，现正通过实验确定这些引物的性能。 （2）本项目的另一技术关键是最佳等温扩增体系优化。通过对 引物浓度、内引物和外引物的最佳浓度比、模板浓度、dNTP浓度、 2+ BstDNA聚合酶用量、Mg 浓度等条件进行优化，能够获得最佳实验条 件。 2、创新点 （1）既往对病原菌的检测一般采用细菌分离培养鉴定法，但该 方法的准确率低，所需时间长，往往延误临床正确的诊断和治疗。近 年来，人们将PCR技术用于病原菌的检测。PCR技术虽然较传统方法 灵敏、快速，但需要较昂贵的仪器设备。更为重要的是，PCR方法容 易产生非特异性扩增产物，造成假阳性和假阴性结果，影响对样品的 正确判断。本项目将建立适合于食品和临床标本大规模检测的环介导 等温扩增快速检测病原菌技术。与目前的检测方法相比，等温扩增法 具有快速、准确、灵敏的特点。而且，等温扩增法是在恒温下进行， 只需一个简单的恒温装置，不需要PCR实验中的昂贵仪器，因而易于 在基层食品质量检测部门和医院推广使用。 （2）目前，国外已有将环介导等温扩增技术应用于病毒DNA和 RNA检测的报道，但将其应用于病原菌检测的文献报道极少，国内基 本上还未开展环介导的等温扩增研究工作。本项目首次提出将环介导 的等温扩增技术应用于食品和临床标本中病原菌的检测，并对目前的 等温扩增方法提出改进策略，发展可同时检测多种病原菌的多重等温 扩增技术，以克服当前一个等温扩增反应只能检测一种DNA或RNA的 缺点。因此，本项目的实施，将开发出具有自主知识产权的病原菌检 测试剂盒。 3、项目完成时达到的技术水平 项目完成时，开发的多重环介导等温扩增快速检测