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病理性瘢痕中结缔组织生长因子免疫组化研究 　　病理性瘢痕是临床上的常见病、多发病，发病机制尚未完全明了。结缔组织生长因子：connective51ssue growth factor，CTGF)是一种促纤维化生长因子，在病理情况下，CTGF的过度表达与某些增生性或纤维化性疾病的发生、发展密切相关，如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化等。本实验旨在通过应用免疫组化(SABC法)染色，图像分析等方法，观察CTGF在病理性瘢痕中表达的差异性，以探讨两者之间的内在关系。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1　标本来源及实验分组：全部瘢痕疙瘩病例均属于增生期。病例入选标准还包括：2年内未接受药物注射、放射或外科治疗；1个月内未予任何外用药治疗；无系统疾病者；无局部皮肤病变。标本均来源于本科。全部共75例，其中男33例，女42例：年龄12～63岁，平均(34±13)岁；病程1～20年，平均(8.28±7.05)年。对照组15例正常人皮肤均取自健康个体躯干上部。其中男6例，女9例：年龄12～53岁，平均(30±13)岁。实验分8组：NS组(正常皮肤组)、SS组(浅表性瘢痕组)、HSS组(增生性瘢痕边缘组)、HSM组(增生性瘢痕中间组)、HSN组(增生性瘢痕边缘外正常皮肤组)和KS组(瘢痕疙瘩边缘组)、KM组(瘢痕疙瘩中间组)、KN组(瘢痕疙瘩边缘外正常皮肤组)。所有标本切取后用PBS冲洗，修剪去皮下脂肪，经10％中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋，切片厚5μm，分别经HE和免疫组织化学染色。 　　 　　1．2　主要试剂与仪器：兔抗人CTGF多克隆抗体、既用型SABC免疫组织化学染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。真彩医学图像分析仪为德国Leica公司MD－20型。 　　 　　1．3　实验方法 　　1．3．1　HE染色：按照常规方法进行。 　　1．3．2　免疫组织化学染色：采用SABC法，石蜡包埋标本、切片后，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化；3％过氧化氢阻断内源性过氧化酶；0.02mol／L柠檬酸微波修复；非免疫性动物血清封闭非特异性抗原；山羊抗人CTGF多克隆抗体稀释度为1:100，4℃孵育过夜；按sP试剂盒说明加生物素标记的二抗，孵育30min后加标记过氧化酶的链霉亲和素孵育30min：DAB显色，以PBS代替一抗作为阴性对照。半数切片不经苏木精复???，留作图像分析，其余切片经苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。同时取乳腺癌及结肠癌的标本做阳性对照。显微镜观察。 　　1．3．3　形态计量学及图像分析：免疫组化切片的染色阳性信号为棕黄色颗粒，阴性对照片无棕黄色着色。将免疫组化切片置于相同强度光线显微镜下，观察表皮、真皮中棕黄色颗粒的表达数量及表达强度；并观测其形态及其分布特征。8组病例分别进行上述观察。每例随机抽取1张CTGF染色切片用图像分析系统分别进行检测。在40倍物镜下每张切片自表皮向真皮深层按系统抽样法随机抽取5个视野，测定棕黄色阳性颗粒的总面积及平均光密度值，然后计算出单位面积的面密度值。 　　1．3．4　统计学处理：用SAS8.0统计软件进行统计分析。数据以均数±标准差(x±s)表示，样本两两比较用q检验对数据进行统计分析，判断均数差异显著性，以P＜0.05为有统计学意义。 　　 　　2　结果 　　 　　2．1　HE染色：观察结果基本与文献报道相同。 　　 　　2．2　免疫组织化学染色：阳性信号主要定位于细胞浆，空白对照片无棕黄色着色。KS组织中CTGF表达阳性细胞数最多，可见大量弥漫性分布的成纤维细胞，着色较深，排列紊乱，极性消失，主要分布于真皮层胶原结节处，大部分呈强阳性着色，特别是真皮深层；表皮基底层也有少量阳性细胞，着色较淡。并且在瘢痕组织的边缘，CTGF表达呈现由强变弱的过渡现象。在KN组织中也有较强的表达。在HS组织，阳性细胞分布与KS相同，但数量少，着色较淡。主要集中于中间部。而在HN组织中的表达极微弱。SS和NS组织中仅有极微弱的CTGF阳性着色，主要在表皮基底层。 　　 　　2．3　图像分析：各组CTGF阳性颗粒面密度值见表1；平均光密度值见表2。 　　 　　3　讨论 　　 　　3．1　CTGF是1991年Bradham等通过应用抗血小板源生长因子抗体筛选人类脐静脉内皮细胞eDNA文库基因表达时首次发现。它主要由皮肤成纤维细胞、肾小球系膜细胞、肝星状细胞、肺纤维连接蛋白、血管平滑肌细胞等间质细胞合成分泌。其作用主要表现为促进成纤维细胞增殖、介导细胞粘附、刺激细胞迁移、促进细胞存活、促进细胞外基质合成、促进细胞凋亡、促进新生血管形成、促进肉芽组织形成和纤维化、促进软骨及骨骼发育等。它被视为转化生长因子β(TGF－β)的下游反应元件，而TG