实验一-质粒提取2011PPT.pptVIP

模块一 重组质粒构建和重组子的筛选与鉴定 模块二 植物遗传转化 模块三 转化烟草的鉴定 前 言 分子生物学与基因工程实验技术 模块一 重组质粒构建和重组子的筛选与鉴定 实验一 质粒DNA的提取和电泳检测 实验二 重组质粒的构建：酶切、目的片段回收、连接实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化实验四 重组质粒的鉴定  1952， J. Lederberg reviews the literature on cell heredity and suggests the term plasmid for all extrachromosomal hereditary determinants. 质粒是一种小的双链环状DNA分子，是独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。 背 景 知 识 1. 质粒与载体 用于基因克隆的载体 必须具备的条件： 1）能够在寄主细胞内独立自主复制； 2）具有可检测的选择性标记； 3）具有多克隆位点； 4）具有较高的外源DNA的载装能力; 5) 具有针对受体细胞的可转移性。 载体种类：有来自大肠杆菌的质粒、λ噬菌体、 M13噬 菌体、噬菌粒外，还有酵母、细菌人工染色 体载体以及动、植物病毒载体。 ①是染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300 kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous replicon）。 Characteristics of plasmids ③质粒对宿主生存并不是必需的。 Relaxed manner – pMB1/colE1复制子 质粒的应用 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。 大多数基因工程使用松弛型质粒。 pGEM?-7Zf(-) Vector circle map and sequence reference points T7 RNA polymerase transcription initiation site 1 SP6 RNA polymerase transcription initiation site 123 T7 RNA polymerase promoter (–17 to +3) 2982–3 SP6 RNA polymerase promoter (–17 to +3) 121–140 lacZ start codon 162 lac operator 182–198 β-lactamase (Ampr) coding region 1319–2179 phage f1 region 2363–2818 binding site of pUC/M13 Forward Sequencing Primer 2939–2955 binding site of pUC/M13 Reverse Sequencing Primer 158–174 常用质粒 背 景 知 识 2. DNA重组 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 +、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。 重组质粒的构建包括质粒酶切、酶切产物目的片段的回收、回收片段与载体连接等步骤，涉及一系列相互关联的酶促反应。 背 景 知 识 3. 电泳 琼脂糖凝胶电泳 Chemical Structu