第五章 X射线晶体衍射技术PPT.pptVIP

X射线晶体衍射技术 在蛋白质晶体结构测定中的应用 X-射线衍射法是测定蛋白质晶体结构的极其重要方法。揭示分子结构与功能的科学。 目前还没有一种工具能够用它直接观察到蛋白质内部的原子和基团的排列。虽然电子显微镜接近于看到大分子的轮廓。但是仍然仅限于揭露分子的大小、形状、对称性和聚集状态等。通过X-射线衍射法（X-ray diffraction method）可间接地研究蛋白质晶体的空间结构。 发展历史 1895年，伦琴(Rontgen)发现了X-ray; 1913年布拉格父子用X射线衍射法对氯化钠、氯化钾晶体进行了测定，指出晶体衍射图可以确定晶体内部的原子（或分子）间的距离和排列。因此获诺贝尔奖。 1951年，加利福尼亚理工学院的泡令和科里提出，α-构型的多肽链呈螺旋形，通过X射线确定，组成蛋白质的都是L-型氨基酸。 1953年克里克、沃森在X射线衍射资料的基础上，提出了DNA三维结构的模型。获1962年生理或医学诺贝尔奖。 1959年佩鲁茨和肯德鲁对血红蛋白和肌血蛋白进行结构分析，解决了三维空间结构,获1962年诺贝尔化学奖. 1959年有机化学家豪普特曼和卡尔勒建立了测定晶体结构的纯数学理论，特别在研究生物大分子如激素、抗生素、蛋白质及新型药物分子结构方面起到了重要作用。因此获1985年化学奖。 X射线衍射技术在蛋白质结构研究方面起到了推动作用 X-射线结构分析基本原理 X-射线是波长很短的电磁波，约0.1--100?。 结构分析用的是单色X-射线，其波长在1?数量级，相当于分子中原子之间的距离。 用于结构分析用的仪器是X-射线仪。由X-射线管、滤波器、高压系统（30-50KV)、真空系统(10-4-10-5 mmHg柱）和照相机组成。 工作原理：由X-射线管产生的各种波长的X-射线，经过滤波器（如镍片等）得到一定波长的单色X-射线。单色X-射线通过晶体，产生衍射线，用照相机记录下来，得到衍射图，然后，通过对衍射斑点的位置与强度的测定与计算，并参照化学分析的结果，就可确定晶体结构。。 用X-射线衍射法测定晶体结构是根据晶体中原子重复出现的周期性结构。 当X-射线穿过晶体的原子平面层时，只要原子层的距离d与入射角的X-射线波长λ、入射角θ之间的关系能满足布拉格方程式。则反射波可以互相叠加而产生衍射，形成复杂的衍射图谱。 不同物质的晶体形成各自独特的X-射线衍射图。根据记录下 来的衍射图谱，经过复杂的数学处理，可推知晶体中原子的分 布和分子的空间结构。 d d 平行光束 原子层 θ 晶体结构的基本知识 日常所见晶体，如：氯化钠（离子晶体）、金刚石（原子晶体）等，外形都是非常有规则的。无论是那一类晶体，组成晶体的微粒在空间的三个方向上，都是周期性排列的。 晶体的空间结构是由一组为数无限的、相互平行的、情况相同的平面点阵所组成。每一个点阵所构成的单元叫晶胞。 知道了晶体的晶胞就等于知道了整个晶体的空间结构。 X-射线结构分析的主要根据是衍射线的方向和强度，即衍射图上斑点的位置与黑度。 衍射线方向：确定晶胞的大小和形状； 衍射线强度：确定晶胞中的原子排列。 三、蛋白质X射线晶体结构测定程序 样品处理：培养大的、质量好的晶体； 蛋白质结晶和晶体生长 晶体衍射数据的测量和处理； 位相确定； 分子模型的建立和修正 获得好的晶体是结构分析中最关键的一步 由于球状蛋白分子量大，且表面基团的构象较不稳定，欲获得排列有序的晶体比较难。 所形成的晶体在分子之间形成许多大的孔或通道。这些通道常常由溶剂分子所占有，绝大部分在晶体中是无序的。 晶体的蛋白质分子之间仅少量的区域发生接触，这些区域的相互作用是较弱的相互作用，通常是通过一个或几个溶剂分子层发生作用。这是为什么由X射线晶体学测定的蛋白质结构与在溶液中测定的蛋白质结构几乎相同的主要原因。 欲获得晶体，蛋白质分子的纯度和均一性是能否获得完好结晶的关键之一。重组DNA技术在这方面是一个很重要的突破。一个蛋白质样品要想使其能结晶，至少需要97%的均一性。 生物大分子的晶体培养要求 要进行x射线晶体结构分析，首先要得到适合于结构分析 的晶体。这里所谓“适合于”包括两层意思： 晶体内部结构要具有有序性．是单晶，不是孪晶，否则无法得到具有结构本身特点的衍射花样； 晶体要有一定的大小和形状。因为晶体衍射线的强度大体上正比于晶体的体积，而反比于分子量的大小。 一般讲分子量为50000左右的蛋白质分子，需要0.3 mm3或者更大的晶体，才有可能作高分辨率的结构分析。对于分子量更大的蛋白质分子，那就需要更大的晶体。为了满足上述要求，首先要使生物大分子结晶，然后设法长大。 蛋白质结晶过程是一个有序化过程 蛋白质晶体培养一般