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小立碗藓在分子生物学方面的研究现状 摘要：本文通过对小立碗藓的研究历史、基因打靶技术、以及发展前景，展现了蕨类植物分子生物学方面的研究现状。 关键词: 小立碗藓 同源重组基因 基因打靶 小立碗藓作为植物分子生物学研究极具前景的模式系统已日益受到人们的重视，它的生活史周期短，易于培养，转基因植株易于分析，核基因组容易和外源DNA发生同源重组，这些特点使它成为研究基因功能的良好材料。一些成功的基因敲除和基因破坏已经在小立碗藓中实现，这些基因的功能也通过小立碗藓转化植株的特点得以证实。小立碗藓标签突变文库已经建立，其应用为小立碗藓基因的进一步研究打下了基础。关于小立碗藓的ESTs数据库已经建立，已有67000条ESTs信息。小立碗藓在分类上属于葫芦藓科，小立碗藓属，分布于欧洲、亚洲、非洲及大洋洲，我国湖南省张家界地区有分布。小立碗藓植物体矮小，黄绿色，有光泽，稀疏丛集。其茎细而短。叶片呈卵形或披针形，茎基部的叶较小，中肋单一、细长。蒴柄短粗，蒴呈圆球形或梨形，孢对称、伸出叶丛，蒴盖分化，不无孢蒴成熟后不规则开裂，蒴齿缺如，蒴帽极小，呈钟形。成熟后基部四瓣浅裂。孢子呈球状肾型(高谦和张大成,2000)。 １.小立碗藓的研究历史对小立碗藓较早的研究始于20世纪60年代。Engel(1968)成功的分离出小立碗藓的硫胺素和烟酸的营养缺陷型突变株。随后，一些科学家对小立碗藓的发育遗传学作了深入的研究,他们利用化学诱变诱导出几种生化突变体和发育突变体。 2.小立碗藓基因的同源重组基因打靶技术是研究基因功能的实用方法，它是利用同源重组将细胞的某一特定基因破坏或敲除，得到的突变型失去该基因的功能，通过这种方法，基因的功能就可以得到确定。基因打靶技术在酵母和细菌以及小鼠细胞的研究中取得了很好的效果，但是在植物中，外源DNA片段与基因组发生同源重组的频率很小，所以通常植物的基因打靶很难实现。而小立碗藓基因组很容易与外来片段发生同源重组，这就使精确的基因打靶技术在植物中的应用成为可能(Schaefer,2002)。通过同源重组技术已获得了一些缺失某一特定功能基因的突变株。Strepp等(1998)破坏了小立碗藓的ftsZ1基因。ftsZ是控制原核生物分裂的基因，它编码的FtsZ蛋白与微管蛋白结构上有相似的特点。在小立碗藓中ftsZ1存在于核基因组中，控制叶绿体的分裂。野生型小立碗藓每个细胞中大约有50个叶绿体，而敲除了ftsZ1的小立碗藓细胞中含有一个大的叶绿体，从而证明了ftsZ1在叶绿体分裂过程中的作用。由腺苷5-磷酸硫酸盐降解酶催化的腺苷5-磷酸硫酸盐（APS）的降解是高等植物中硫酸盐消化的关键步骤。有人提出，在植物中还存在着磷酸腺苷5-磷酸硫酸盐（PAPS）支路，但其相关酶磷酸腺苷5-磷酸硫酸盐降解酶是否在植物体中存在并不能确定。Koprivova等(2002)利用同源重组技术将小立碗藓中编码腺苷5-磷酸硫酸盐降解酶的基因破坏，使其不能正常转录，酶活性完全丧失。结果发现，转化得到的植株仍可利用硫酸盐作为惟一硫源。结果证明了PAPS支路在小立碗藓中的存在。 3.展望小立碗藓作为植物分子生物学的研究材料，有着其他材料无法比拟的优势。它容易培养，突变型易于分析，基因组容易和外源基因发生同源重组，这些特点使它成为研究基因功能的良好材料。一些成功的基因敲除和破坏也从实践上证明了这一点。小立碗藓标记突变文库的建立为小立碗藓基因的进一步研究打下了基础。但是，由于小立碗藓是新兴的植物分子生物学模式系统，对它的研究还有很多不足之处。首先，小立碗藓的研究平台还不完善。在国际上，并没有小立碗藓核基因组物理图谱的发表，由此可见，小立碗藓核基因组的测序工作尚未进行。核基因组包含整个植物体的全部信息，一些不转录的信息（如启动子、内含子）通过ESTs是无法研究的，，但都可以在序列图中得到反映，所以，对基因组的测序是对小立碗藓基因组进行高通量研究的基础。在国内，一方面，建立分子生物学研究所必要的小立碗藓cDNA文库和基因组DNA文库是非常迫切的；另一方面，随着小立碗藓研究的广泛进行，需要利用半连续式光合自养生物反应器获得大量原生质体。其次，对小立碗藓同源重组率高的机理的研究工作不够。现在科学家往往把精力集中在通过基因敲除研究某一基因的功能上。然而，小立碗藓的基因组只能代表所有陆生植物基因的一部分，而大量的基因并不能通过基因敲除进行研究。那么是否可以通过研究并应用小立碗藓基因同源重组率高的机理来解决这一问题呢？科学家已经开始研究小立碗藓同源重组的机理，一种与同源重组有关的蛋白RAD51的基因已经从小立碗藓的基因组中分离出来(Markmann-Mulischetal.,2002)。有的观点认为，小立碗藓的同源重组率高与其特殊的细胞周期有关(Schweenetal