第四章 细胞与酶固定化.ppt

第一节 概述 第二节 酶固定化 第三节 微生物、植物和动物细胞固定化 第四节 原生质体固定化;一、酶与细胞固定化的概念 二、天然酶在应用中的一些缺陷 三、固定化酶特点 四、固定化酶的发展史;一、酶与细胞固定化的概念 ;;1、不溶于水: 反应完成后，经过滤或离心等简单分离，就可以回收，以重复使用，降低酶制剂成本。 2、具有一定的机械强度: 可将其装成酶柱，当底物溶液缓缓流经酶柱时，就能发生酶促反应，流出液中，即含有酶促反应产物，其产物不易带杂质，收率高，易精制。 3、稳定性提高: 一根酶柱往往可以连续使用数十次，而酶活力并无明显下降。;四 固定化酶的发展史;一、基本概念;①物理吸附法 通过载体表面和酶分子表面之间的氢键、疏水键和π-电子亲和力等物理作用力，将酶固定于不溶性载体（固体吸附剂）的方法，称为物理吸附法，简称吸附法。;常用吸附剂：; 是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。 最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。 离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。;（2）制备方法：;c. 混和振摇装载法： 是实验室常用方法，载体与酶液混和后，要在搅拌下或摇床连续振摇下完成固定化。 该法固定化较为均匀，要注意搅拌或振摇速率，既不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。 d. 反应器装载法： 这是工业上常用方法，它将固定化和其后的应用连在一起，即先将载体装于反应器中，再加上酶液，然后通过循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。;①pH：影响载体和酶的电荷变化，从而影响酶吸附。 ②离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。 ③蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。 ④ 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 ⑤吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。 ⑥载???：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。;（4）吸附法的优点、缺点;(1) 基本概念：将酶或含酶菌体包埋于各种多孔载体中，使酶固定化的方法，称为包埋法。 (2) 包埋常用载体： 琼脂、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、琼脂糖、角叉菜胶等。 (3) 包埋法的类型：主要有胶格包埋、微囊型包埋、脂质体包埋。;a. 胶格包埋或称凝胶包埋： ① 常用凝胶： ;② 制备方法：;以合成胶为载体（如聚丙烯酰胺凝胶）： 先将酶和丙烯酰胺单体分散于水介质中，然后加入聚合促进剂和N.N’-甲叉双丙烯酰胺聚合，酶即包埋于形成的凝胶中。 特点：合成胶强度高，对温度、pH变化耐受性强，但要控制好包埋条件。;b. 微囊型包埋又称半透膜包埋法：;相分离法： 利用高聚物在水相和有机相的界面上溶解度降低而凝聚，易形成皮膜而将酶包埋于中。 例： 以火棉胶（硝酸纤维素）包埋酶时，先将酶的水溶液在含有硝酸纤维素的乙醚溶液中乳化、分散，然后再加入苯甲酸丁酯，促使硝酸纤维素在酶液液滴周围凝聚，最后用Tween20破乳化后，就可得到含酶的火棉胶囊。;界面聚合法： 利用在微滴的界面通过加成或缩合反应形成水不溶性多聚体制成微囊包埋酶。 例：以尼龙膜包埋酶时，将酶液及亲水性单体（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，将疏水性单体（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等与水混溶的有机溶剂。然后，将这两种互不相溶的液体混和在一起。加入乳化剂乳化，使酶液分散成小液滴。此时，亲水性的已二胺与疏水性的癸二酰氯就在二相界面聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加Tween-20，使乳化破坏，用离心分离即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。;表面活性剂乳化液膜法： 在酶的水溶液中添加表面活性剂，使之乳化形成液膜达到包埋的目的。该法不含化学反应，简便，而且固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。;C、脂质体包埋： 将酶包埋于脂质体(Liposome)中的方法。脂质体是指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。 脂质体包埋的特点： 具有一定的机械性能，能定向将酶等被包裹物携带到体内特定部位，然后将被包裹物质释放。因此，其在药物应用方面受到重视。;包埋法的优点、缺点:;(1) 基本概念： 选择适宜