第一章技术原理.ppt

基因芯片的应用 DNA测序：杂交测序（SBH） 基因表达分析：cDNA chip 检测大量mRNA，且敏感地反映基因表达中的微小变化。 基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达。 基因突变：砖式微阵列，特点：25bp，四个一组 仅中间一个分别为A、T、G、C，其余相同。 药物研究与开发：如用基因微阵列对各种化合 物对肿瘤细胞基因表达进行分析，筛选抗肿瘤物质。 分子杂交(简称杂交,hybridization)是核酸研究中一项最基本的实验技术。其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不同的DNA(或RNA)片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子(heteroduplex)。 将DNA用合适的限制性内切酶酶解电 泳后，用碱处理使凝胶中的DNA变性成单 股DNA，转移至硝酸纤维滤膜或尼龙膜上 ，并固定；选择合适的已标记的探针（放 射性核素或生物素、地高辛(digoxigenin) 等），进行分子杂交；滤膜经放射自显影 (autoradiography)处理后，即可得杂交DNA 条带的放射自显影图 . 三、蛋白质免疫印迹(Western-blotting) 组织原位杂交（tissue in situ hybridization） 在组织、细胞及染色体上检测特异DNA或 RNA序列的一种技术，是一种直接，简便的研 究基因定位和表达的方法。 DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交。 (3)DDRT-PCR（差别显示反转录PCR） 练习题 PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息? 什么是菌落原位杂交? 说明Southern杂交的原理和方法。 Northern印迹与Southern印迹有什么不同? 利用VNTR序列中无切点的限制性内切酶如Hinf I，酶切基因组DNA后，形成长短不等的许多DNA片段。电泳分开不同大小的DNA片段，用VNTR核心序列作为标记探针进行Southern印迹杂交，不同个体出现一系列不同的杂交带型，从而做出个体识别或指正确认罪犯。串联重复序列可变数。小卫星DNA。 Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。 使其成线状单链 Northern杂交与Southern杂交相比，条件要严格些，特别是RNA容易降解，前期制备和转膜过程易受RNase污染，要获得较好结果，需用稳定性最差的mRNA与DNA进行杂交，对实验条件要求严格；然而有些应用中Northern杂交避免用复杂探针筛选cDNA文库的繁 Northern 不需要酶切 Northern杂交是研究基因表达的最严谨的方法之一，可以定量分析组织中 某一特异mRNA的表达丰度，根据其迁移的位置也可判断基因分子大小。这一技术应用十分 广泛 与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。但与Soughern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质或发光 荧光标记的原位杂交,即FISH技术。 NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。 选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用符合细胞内环境的生理范围(pH) 氯仿变性作用不如酚，但酚与水有一定的溶解度，损失DNA。 最好1：1混合使用。