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光谱校正原理和常见问题 研发部 宋欣欣 光谱校正原理 GoldenEye16A Matrix Standard简介 Matrix校正3100常见问题及解决方案 光谱校正原理 荧光和荧光物质 何为Matrix？ DyeSet/FilterSet 评价Matrix的参数 荧光和荧光物质 3100的Matrix 5×20 横向：20个Bin 纵向：5 dye DyeSet/FilterSet DyeSet FilterSet Virtual Filter 决定CCD上的哪部分区域被激活，相应部分的可见光被收集 Q值表示得到的matrix与理论值间一致性的参数。Q值为1.0表示实际matrix与理论值完全相符，无任何pull－down或pull－up峰。 minQ表示对pull-up或pull-down峰的容忍度。默认值为0.95。进行光谱校正后，软件会自动计算得到每根毛细管的Q值，Q值小于minQ（0.95）时，校正失败。 评价Matrix的参数 C值 表示染料组合中各染料发射光谱的重叠程度。 若染料峰间无重叠，则C值为1.0,为最低可能值。随重叠程度增加，C值相应增大。 ConditionBounds是由两个作为范围的上下限的C值组成，形式如[4,7]。由于仪器间存在轻微差异，需要定义ConditionBounds的范围。 不同的染料组合，其ConditionBounds范围不同。AB3100 DyeSet D [4,8.5]不一定适用于16A。 GoldenEye16A Matrix Standard 四种带有不同荧光标记的片段组成： 100bp（ROX） 130bp（TMR） 180bp（HEX） 200bp（FAM） 峰高范围 不能低于750RFU 1000-4000之间最为适宜 3100校正图 377/310校正－ GoldenEye16A Matrix Standard Matrix校正3100常见问题及解决方案 一、Insufficient number of dye spectra detected! Check raw data... 没有检测到足够数量的信号峰。 Saturated data detected. Calibration failed.检测数据饱和，校正失败 Bad dye order detected. 检测到的染料顺序错误。 Failed quality check: q=0.93807 is less than minQ threshold (0.95000) * Mixture of dye-labeled PCR products from multiplex PCR reaction Sample Separation Sample Detection CCD Panel (with virtual filters) Argon ion LASER (488 nm) Color Separation Fluorescence ABI Prism spectrograph Capillary Sample Injection Size Separation Processing with GeneScan/Genotyper software Sample Interpretation Figure 13.8, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition ? 2005 Elsevier Academic Press 什么是荧光？ 某些物质吸收特定波长的光能量，使分子从基态(S0)转化成激发态(S1) 。 被激发的分子通过内部转化过程失去能量，重新回到具有最低能量的基态。 分子回到基态的同时，发射出更高波长的光——荧光。 h?ex h?em ? ? ? So S’1 S1 energy (a) Excitation Emission Wavelength (nm) ? ? ?ex max ?em max Fluorescence (b) Stokes shift Figure 13.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition ? 2005 Elsevier Academic Press 6 - Carboxy - X - rhodamine 605 580 ROX（CXR） 574 553 NED carboxy-tetramethylrhodamine 578 559 TAMRA(TMR) 554 538 VIC 6-carboxy-4′,5′-dichloro-2′,7′-dimethoxy-fluorescein 548