基因工程载体--质粒PPT.ppt

环丝氨酸富集法示意图 AmpsTets 非转化子 AmprTetr 转化子(无插入片段) AmprTets 转化子( 带插入片段) 转化混合物 氨苄青霉素选择 四环素＋环丝氨酸选择 通常用α互补现象的检查。很多质粒载体DNA都有一段(来自大肠杆菌DNA)含β半乳糖苷酶基因(LacZ)的调控序列和该酶基因氨基端146个氨基酸编码信息。并在这个编码区中加入一个多克隆酶切位点，并不破坏阅读框。而宿主菌有编码半乳糖苷酶C端部分序列，宿主菌和质粒编码片段各自基因都不完整，都没有酶活性，当质粒转化入宿主菌后就会产生具有酶活性的蛋白质，加入生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)后会形成蓝色菌落。而插入DNA的重组子则破坏了LacZ的阅读框，不能使X-gal变蓝，而产生白色菌落。这种LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体(宿主菌)与带有完整的近操纵基因片段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体(质粒载体)之间实现互补，这种互补现象称为α互补。这样通过明显的颜色变化，挑选重组子则变得简单易行。往往在这过程中还要加入IPTG(异丙基硫化-β-D-半乳糖苷)作为酶反应催化剂。 4. 显色法筛选重组子 质粒DNA有一段（来自大肠杆菌DNA）含β半乳糖苷酶基因（Lac Z）的调控序列和该酶基因氨基端146个氨基酸编码信息。在这个编码区中加入一个多克隆酶切位点，不破坏阅读框。宿主菌有编码半乳糖苷酶C端部分序列，宿主菌和质粒编码片段各自基因都不完整，都没有酶活性，当质粒转化入宿主菌后就会产生具有酶活性的蛋白质，加入生色底物X—gal后会形成蓝色菌落。而插入 DNA的重组子则破坏了Lac Z的阅读框，不能使X—gal变兰，而产生白色菌落。这种突变体（宿主菌）与质粒载体之间互补现象称为α互补。入IPTG作为酶反应催化剂。 通过颜色变化筛选重组子。通常用α互补现象的检查 ?互补原理: 质粒的Lac Z仅编码?-半乳糖苷酶的氨基端 宿主菌的Lac Z仅编码?-半乳糖苷酶的羧基端 均无活性 各自编码的肽链可以融为一体，形成具有酶活性的蛋白。 5-嗅-4-氯-3-吲哚- ?-半乳糖苷（X-gal) 蓝色产物 ?-半乳糖苷酶 异丙基硫代-?-D-半乳糖苷 （IPTG) 蓝-白斑实验 构建的质粒人工载体，应用最广的是PBR322，分子量为2.6×106，含46332bp。含有选择标记抗氨苄青霉素（Apr）基因来自天然质粒RSF2124和抗四环素（Ter）基因来自PSC101质粒。复制子部分来自PMB9（一类Co1E1质粒）。多克隆限制性内节切酶位点有9个 * 基 因 工 程 载体 南 京 农 业 大 学 陈 溥 言 概 述 基因工程是利用酶学方法将不同来源的DNA或cDNA，在体外切割、修饰、连接插入到不同目的的基因工程载体中，进行扩增和表达，研究基因结构和功能，基因和蛋白质关系的一种分子生物学技术。 载体 基因工程的十分重要的工具。载体DNA分子中是有一段生长扩增的非必需区，该区经人工改造后可插入外源的DNA，并可送入宿主细胞中，使外源DNA与载体DNA重组并共同扩增。 目前的载体主要有： 1,质粒（Plasmid）载体2,入噬菌体3,柯斯质粒（Cosmid）4,M13噬菌体5,杂交质粒6,病毒载体，包括穿梭载体（Shuttle ）。7,细菌人工染色体.(bacterial artificial chromosome，Shizuya，1992 BAC)8,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，Merry，1983 YAC)9,来源于P1的细菌人工染色体（P1-derived artificial chromosome PAC, loannon，1994）、10,哺乳动物人工染色体（MAC，mamal artificial chromosome，Farr，1991）11,人类人工染色体（HAC，human artificial chromosome，Harrington,1997）12,植物人工染色体(PAC) 质 粒 载 体（Plasmid）