流式细胞仪的原理介绍说明.ppt

2.双 参 数 直 方 图 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 双 参 数 直 方 图 点 图 绿色荧光强度 红色荧光强度 （三）设 门 分 析 技 术 1.Gate设置：指根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群。 根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。 A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞 A、B、C均为任意门 线性门 2. 区阈（Region设置）: 如十字门分析时，由四个区阈构成，即G=D1+D2+D3+D4。 D1：CD4+/CD3- D2：CD4+/CD3+ D3：CD4- /CD3- D4：CD4- /CD3+ 六、流式细胞仪免疫分析的技术要求 样本制备 标记染色 质量控制 （一）免 疫 样 品 的 制 备 培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤 单细胞悬液 单 细 胞 悬 液 的 制 备 与 保 存 新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 单细胞悬液的保存 深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月） （二）常 见 的 荧 光 染 料 名称 染料 激发波长 荧光颜色 溶解性 对PH敏感性 特点 异硫氰酸荧光素 FITC 488 绿 525 易 敏感 易溶于水，与抗体结合不影响特异性 得州红 Texas red 568 红 615 不易 不敏感 稳定，偶联后量子产额低 藻红蛋白 PE 488 橙 575 易 不敏感 具较多发光基团，消光系数和量子产额高 藻青蛋白 PC 488 别藻青蛋白 APC 633 红 670 能量传递复合染料 PEcy5 488 红 670 易 不敏感 减少交叉，成本高 （三）免 疫 荧 光 标 记 荧光染料与细胞成分的四种结合方式 结构亲和式 嵌入结合 共价键结合 荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法 直标:干扰少,但需购买多种单抗 间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体 （三）流式细胞免疫学技术的质量控制 1.单细胞悬液制备的质控 适当的制备方式 实体组织来源标本用机械法 温度25-37℃，pH7.0-7.2 2. 免疫荧光染色的质控 温度 pH 染料浓度 固定剂 3. 仪器操作的质控 光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。 PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准: 保证计数的准确性。 4. 免疫检测的质控 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。（通常采用未染色细胞作为阴性对照） 全程质量控制：同型对照与待测标本一起标记和检测，该实验结果可靠。 七、流 式 细 胞 仪 的 科 研 应 用 树突细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究 流式细胞术在免疫检验中的应用 FCM 在 细 胞 生 物 学 中 的 应 用 DNA 细 胞 周 期 分 析 S cell division G1 (DNA synthesis) G2 M (mitosis) 细 胞 周 期（cell cycle） G1期(DNA合成前期)　从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，此期主要合成RNA和核糖体。 S 期(DNA合成期)　除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。 G2期(DNA合成后期) 大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。 M期（细胞分裂期）由一个母细胞分裂成为两个子细胞 。 G0期（细胞休眠期）暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一定生物学功能的细胞所处的时期 。 　 流式细胞仪的原理及应用 马 黎 明 生命科学与技术学院 流式细胞术的基本概念 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行多参数定量分析和分选的新技术。 流 式 细 胞 术 的 特 点 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细