阻断磷脂酶c-γ- c-信号通路对卵巢癌细胞生长和凋亡的影响.docx

材料一、研究对象人上皮性卵巢浆液性乳头状囊腺癌（ＳＫＯＶ３）细胞株，复旦大学附属妇产科医院研究所提供。二、试剂ＲＰＭＩ一１６４０培养基小牛血清胰蛋白酶Ｕ７３１２２碘化丙啶（ＰＩ）四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）ＡｎｎｅｘｉｎＶ－Ｆ１ＴＣ试剂盒三、仪器ＣＤＡ．１６５０．２垂直面对面工作台杭州吉诺生物医药技术有限公司产品杭州四季青生物工程材料有限公司产品华美生物工程公司产品Ｓｉｇｍａ公司产品Ｓｉｇｍａ公司产品Ｓｉｇｍａ公司产品华美生物工程公司产品晶美生物工程有限公司产品上海上净净化设备有限公司产品ＨｅａｌＦｏｒｃｅＨＦｌ５１ＵＶ细胞培养箱上海力申科学仪器有限公司产品培养瓶和培养板ＣＫ．２型倒置相差显微镜ＭＨ．１型微量振荡器ＬＸＪ．１１型离心沉淀机杭州生友生物技术有限公司产品日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司产品江苏海门其林医用仪器厂产品上海医用分析仪器厂产品ＢＩＯ．ＲＡＤ３５５０型酶联免疫检测仪ＢＩＯ．ＲＡＤ公司产品Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ流式细胞仪６ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ公司产品方法一、细胞培养（１）将ＳＫＯＶ３卵巢癌细胞株用含１０％ｄ，牛血清的ＲＰＭｌ．１６４０培养基５ｍｌ，置于５０ｍｌ培养瓶中，在５％Ｃ０２，３７℃培养箱中培养。（２）更换培养基２．３次／周，０．２５％胰蛋白酶消化分散细胞，进行传代或接种。倒置显微镜观察细胞生长。（３）无菌操作配制Ｕ７３１２２浓度为１、５、ｌＯ、２０、５０、１００ｐｍｏｌ／Ｌ［１１１的含药培养基。二、ＭＴＴ法（１）待对数生长期的ＳＫＯＶ３细胞长至７０％。８０％时，调整其浓度为２ｘ１０４个／ｍｌ，接种于９６孔板，每孔２００ｐｌ，每组５个孔。（２）继续培养２４ｈ后，向各组各孔加入以上浓度的Ｕ７３１２２含药培养基，并设不加Ｕ７３１２２的对照组。（３）分别继续培养２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ。每孔加入２０９ｌ５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ溶液，３７。Ｃ孵育４ｈ。（４）移去ＭＴＴ溶液和培养基，每孔加入１５０ｐｌＤＭＳＯ，置于微量振荡器上振荡１０ｍｉｎ。（５）待结晶物完全溶解，酶联免疫检测仪上以波长为４９０ｎｍ测吸光度值。重复三次。三、流式细胞仪（１）细胞凋亡①待对数生长期的ＳＫＯＶ３细胞长至７０％一８０％时，调整其浓度为２×１０４个／ｍｌ，接种于６孔板，每孔２ｍｌ，每组５个孔。②继续培养２４ｈ后，向各组各孔加入１、１０、１００ｐｍｏｌ／Ｌ不同浓度的Ｕ７３１２２含药培养基，并设不加Ｕ７３１２２的对照组。③分别继续培养２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ。收集细胞１０６个。④４。Ｃ预冷的ＰＢＳ溶液洗涤２次，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。⑤ＰＢＳ：结合缓冲液按４：１每流式管加入１００９ｌ，再加入５１ｘｌＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＦＩＴＣ和１０９ｌ２０９９／ｍｌＰ１，混匀后室温避光孵育１５ｍｉｎ。⑥每管加入４００９ｌＰＢＳ溶液，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。重复三次。（２）细胞周期①同上收集细胞１０６个，４℃预冷的ＰＢＳ溶液洗涤，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。②７０％酒精ｌｍｌ固定３０ｍｉｎ后再离心５ｍｉｎ。ＰＢＳ溶液再次洗涤。③加入５０９９／ｍｌＰ１０．５ｍｌ，室温避光孵育１５ｍｉｎ后，流式细胞仪检测细胞周期。四、观察指标１．计算细胞生长抑制率：［（对照组ＯＤ值．处理组ＯＤ值）／对照组ＯＤ值１×１００％。２．流式细胞仪检测细胞凋亡率。３．流式细胞仪观察细胞周期变化。五、统计方法采用ＳＰＳＳｆｏｒｗｉｎｄｏｗｓＶｅｒ．１２．０统计软件对数据进行处理，采用双因素方差分析。各指标均以均数±标准差表示，以Ｐ＜Ｏ．０５或Ｐ＜Ｏ．０１认为差异存在统计学意义。结果一、ＰＬＣ—Ｙｔ信号通路被阻断后，ＳＫＯＶ，卵巢癌细胞生长情况的变化应用不同浓度的ＰＬＣ—Ｙ１的化学阻断剂Ｕ７３１２２作用于卵巢癌细胞株ＳＫＯＶｓ，分别作用２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ后，ＭＴＴ法检测细胞生长情况，测得ＯＤ值见表１，计算后所得的抑制率见表２及图１。空白对照ｌｕｍｏｌ／Ｌ表１不同时间浓度的ＯＤ值２４ｈ４８ｈ１．１８４８酊丽丽■———万前面■～１．２８０００．９０３８鼍够∥。。尚锨而咿蚁、５ｕｍｏｌ／ＬｌＯｕｍｏｌ／Ｌ２０且ｍｏｌ／Ｌ５０ｕｍｏｌ／Ｌ１．２０７５１．２０２８１．１３４５０．４６２５０．７８８３０．７９１９０．７１６００．３３３２０．４３８２０．４３６７０．４１５９０．０８５８１００ｕｍｏｌ儿０．１１０３０．０８２００．０７１８表２不同时间浓度的细胞生长抑制率（％）度ｌｇｍｏｌ／Ｌ５９ｍｏｌ／Ｌ１０９ｍｏｌ／Ｌ２０９ｍｏｌ／Ｌ５０ｐｍｏｌ／Ｌ１００ｕｍｏ］／ｌ。２４ｈ７．０３１０．８７—０．６０±ｏ．０６—０．２０－－＋０．１２５．１８＿－ｔ＿－０．８１６１．２６－＋０２—６—面７２五而Ｆ４８ｈ一０．３６－１－０．０４１２．４５－ｔ－０．１４１２．１４－１－０．０９２１．４