第二章 基因工程及其在食品科学中的应用PPT.ppt

所谓穿梭载体(shuttle vector)，是指可在两种截然不同的生物细胞中复制的载体 (3) 附加体型载体(YEP) 该类载体一般由大肠杆菌质粒、2μm质粒及酵母染色体的选择标记组成。 YEP的结构 (三) 植物载体 植物载体具体包括农杆菌质粒载体、病毒载体等，农杆菌质粒载体又可分为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens，At)诱导肿瘤质粒(tumor-inducing plasmid，Ti plasmid)载体和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes，Ar)诱导发根质粒(root-inducingplasmid，Riplasmid)载体。 在所有这些植物载体中，根癌农杆菌诱导肿瘤质粒载体是最主要的 根癌农杆菌主要感染被子植物中的双子叶植物。 根癌农杆菌感染植物会致其形成冠瘿瘤，而这种肿瘤的形成是由根癌农杆菌中的质粒引起的。因此，该质粒被称为诱导肿瘤质粒，简称Ti质粒。 1、Ti质粒的基本性质 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为共价闭合环状的双链NA分子。其分子量为1.2X108，长约185kb，相当于细菌染色体的3％一5％。 根据植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱的种类，一般可以将Ti质粒分为以下类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)等。 2、Ti质粒的基本结构 一般可将Ti质粒分为四个结构区域：T-DNA区、Vir区、Con区和Ori区。 (1) T-DNA区(transferred-DNA region)。T-DNA是在根癌农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞内的一段DNA，因此，被称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 (2) Vir区(virulence region)。该区段上的基因能够激活T-DNA转移，使根癌农杆菌表现出毒性，因此，被称为毒性区。 (3) Con区(region encoding conjugation)。该区段上存在着与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在根癌农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒的转移。因此，该区被称为接合转移编码区。 (4) Ori区(origin of replication)。该区段上的基因调控了质粒的自我复制，因此，被称为复制起始区。 3、植物基因工程中几种载体的定义 (1) 中间克隆载体(intermediate cloning vector)。这是指插入了根癌农杆菌Ti质粒T-DNA片段、目的基因、标记基因等的大肠杆菌质粒载体。它是构建中间表达载体的基础质粒。 (2) 中间表达载体(intermediate expression vector)。这是指含有可使外源基因在植物细胞中表达的特异启动子的中间克隆载体。它是构建植物表达载体的基础质粒。 (3) 卸甲载体(disarmed vector)。卸甲载体多指去除了编码致瘤作用基因、经改造的根癌农杆菌Ti质粒载体。其是构建植物表达载体的受体质粒。 (4) 植物表达载体(plant expression vector)。这是指最后将目的基因导人植物细胞表达的载体。它由中间表达载体和卸甲载体构建而成。 4、植物表达载体 (1) 植物表达载体(中间表达载体)中常用的启动子。 (2) 一元载体系统 ① 共整合载体(co-integrated vector) ② 拼接末端载体(split-end vector，SEV) (3) 双元载体系统 ① 双元载体系统的构建原理 ② 双元载体的构建 (四) 动物载体 DNA病毒是外源DNA导入哺乳动物细胞的理想载体。其中，常用的载体由野生型猿猴空泡病毒40(SV40)基因组DNA等改建而成。 SV40病毒 ： 猿猴空泡病毒40(simian vacuolating virus 40)，即SV40病毒，是一种小型20面体的颗粒，外壳由VPl、VP2和VP3三种病毒蛋白构成，中间包装着长5.2kb的环状基因组DNA。 SV40基因组DNA分为早期和晚期两大区域。早期区在溶原生长中一直表达，而晚期区仅在DNA复制后的一段时间中表达，产生病毒外壳结构蛋白。早期区与晚期区之间则为复制起点。 四、基因工程中的一些主要分子生物学方法 (一) 核酸分子探针的标记 探针(probe)是指在化学及生物学意义上能与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法所测定的分子。 核酸分子探针是指能与互补核酸序列复性杂交的特定已知核酸片段。 ．