牙质片层培养基使用说明书.PDFVIP

牙质片层培养基使用说明书 【产品名称】 通用名称：牙质片层培养基 【包装规格】 50 片/包 【预期用途】 用于破骨细胞的培养。 骨切片检测能与从实验动物（包括小鼠、大鼠、鸡、兔和猫）的骨分离的破骨细胞同时使用。它 已被广泛用于研究通过直接分离于骨或培养自骨髓培养基的人破骨细胞重吸收 (4) 。该领域当今主要优 势之一是通过RANK配基的增加从外周红细胞诱导破骨细胞形成的技术的发展(9) 。利用这项技术，大 量功能性破骨细胞能被激活，被激活的功能性破骨细胞将在包括骨位点重吸收的牙质片层在内的矿化 底层挖掘出重吸收间隙。重吸收很容易被反射光显微镜方法而量化。 【产品简介】 牙质片层以50片一包形式供应，包装于已消毒的旋转盖封容器内。该片层通过紫外线杀菌并且只 能在无菌环境（如层流柜）中打开。 失活的牙质片层用作骨重吸收培养基。这些片层以 5 mm 直径的牙质薄片形式提供（正常厚度为 0.3 mm ）。每批培养基均经过检测以确保被有功能的破骨细胞重吸收。另可提供预重吸收的样品片层 以便于体外重吸收功能鉴定 【检验原理】 该产品被设计利用“骨切片检测” 以实现体外骨重吸收量化(1,2)，在“骨切片检测” 中，培养的破骨细 胞在矿化的底层挖掘出真正的骨重吸收间隙。从该检测的第一个表述开始，在过去的16年间(1,2)，该 检测已被广泛地应用于研究许多因素对骨重吸收的影响且是当今体外骨重吸收研究使用最广泛的方 法。 【储存条件及有效期】 该产品可在室温下储存。如果容器不打开且片层保持干燥，在保质期内不会出现变质。 【适用仪器】 适用于培养箱使用。 【样本要求】 使用前取样。 【检验方法】 1. 牙质片层在已消毒的塑料容器中提供。仅允许在无菌环境（如层流柜）中打开。 2. 打开容器后，需使用消毒镊子移开消毒棉塞。然后片层应通过颠倒试管转移至已消毒的皮氏培养 皿。 3. 用细镊子将片层移至培养皿备用，注意不要刮到牙质表层。该片层被设计可应用在标准的96孔组 织培养盘中，但是它们也能在任何类型的组织培养容器中使用。 4. 在增加细胞之前，牙质片层应被预加湿至少1小时。应使用消毒磷酸盐缓冲液或组织培养方法。 5. 去除预加湿液后，加入细胞悬浊液。加入的细胞数量取决于破骨细胞来源和实验设计。重吸收由 光显微镜法进行分析，这样就有可能测量单个破骨细胞的活性。然而，在大部分实验方案中，加 入更多的破骨细胞将更合适（但是一般要少于200/牙质片）。 6. 使用的沉淀时间也取决于破骨细胞来源和实验设计。成熟的破骨细胞将在1小时内附在牙质片层， 但是在许多方案中将需要更长的沉淀时间。培养基能通过使用包括自动移液管在内的标准组织培 养技术和设备而被改变。 7. 由成熟破骨细胞导致的重吸收在培养12小时后可被检测出。培养的时间将取决于实验设计。 8. 如果使用液态固定液，牙质片层可在组织培养容器中固定。撤除受限的培养基且用磷酸盐缓冲液 或组织培养基冲洗组织培养孔两次，再加入固定液。常使用的固定液是4% 的戊二醛（用0.2M的甲 胂酸钠溶液配成）。 9. 重吸收凹点能在多种标准组织学菌株着色后鉴定。我们推荐1%的甲苯胺蓝（用0.5% 四硼酸盐溶液 配成）。牙质片层应在此甲苯胺溶液中染色3分钟。多余的染料通过冲洗去除，然后在非蒸馏水中 漂洗并风干。已染色的片层可即在室温下长期保存。 10. 重吸收陷窝能通过多种途径鉴定，包括扫描电镜和光学显微镜。我们推荐使用反射光学显微镜。 11. 使用者应考虑一些推荐的方法以确定最合适他们需要的技术。 举例体外产生人破骨细胞的方法 这个方法使用20 mL 的外周血细胞将可提供适用于近50个牙质片层的足够的破骨细胞。 1. 准备已消毒的牙质片层并置于96孔板的微孔中。每孔一个牙质片层。加入100 μL 的最低必需培养基 (　MEM)加10%的小牛胎血清(FCS)到每个预湿的牙质片层孔中。 2. 混合20 mL 的肝素抗凝的外周血和20 mL 的　MEM 。准备有5个5 ml Histopaque9 （Σ）的Falcon试管 并加入8 ml的外周血细胞悬浮液。在450 g下离心30分钟并轻轻倒出淡黄色表面层。 3. 在10 mL的　MEM清洗淡黄色表面层并在1500 rpm离心20分钟。重悬