与植物载体表达的重组 -李静 -PPT.ppt

Ti质粒的改造： （1）除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，制成卸甲的Ti质粒，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物； （2）除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长； （3）除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度; 安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列； （4）安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作； 载体改造及构建 改造后符合的要求： （1）保留T—DNA的转移功能。 （2）取消T—DNA的致瘤性，使之进入植物细胞后不至于干扰细胞的正常生长和分化，转化体可再生植株。 （3）通过简便的手段可使外源DNA插入T—DNA中，并随着T—DNA整合到植物染色体上。 * Free template from 载体改造及构建 根据中间载体开转化发出两类载体系统： ㈠ 一元载体系统（共整合载体系统） ㈡ 双元载体系统 * Free template from 转化载体系统的构建 ㈠ 一元载体系统（共整合载体系统） 由中间表达载体与改造后的受体Ti质粒组成。在农杆菌内通过同源重组将外源基因整合到修饰过的T—DNA上，形成可穿梭的载体，在Vir基因产物作用下完成目的基因向植物细胞的转移和整合。 转化载体系统的构建 同源序列：PBR322 受体质粒：PGV3850为例 受体Ti卸甲载体及中间表达载体的构建 中间表达载体导入农杆菌 中间表达载体与受体Ti质粒的同源重组 共整合载体的选择 表达载体的结构 改造后的Ti质粒 中间载体含有与PGV3850同源序列，单交换形成共整合质粒 Str链霉素抗性基因 Ampr氨苄青霉素抗性基因 由大肠杆菌质粒衍生而来的中间表达载体，均表现为表达缺陷型，不能自主转移，只在具有接合转移功能的协助质粒的存在下才能被动的完成转移。根据中间载体是否有ｒｅｃＡ依赖性重组和协助质粒本身是否转移，可将中间载体的接合转移分为传导和供给两种形式。传导转移的特点是依赖ｒｅｃＡ介导的重组，协助质粒本身也是从大肠杆菌转移到农杆菌中，转化率高，又称为动员。 ㈠ 接合转移法 将三种相关菌种混合在一起培养，进行杂交，该三种菌株分别是：含有辅助质粒的大肠杆菌菌株，如ｐＧ２含有ｐＧＪ２８和Ｒ６４ｄｒｄ１１质粒：含有重组的中间载体的大肠杆菌菌株，如ｐＬＧＶ１１３０的ｐＢＲ３２２：含有受体Ｔｉ质粒的农杆菌菌株，如ｐＧＶ３８５０.在混合培养中，通过杂交使辅助质粒先转移到含有重组中间载体的菌株中，然后中间载体再被动员和转移到农杆菌中去。 ㈡ 三亲杂交转移法 Free template from Free template from Free template from Free template from Free template from Free template from Free template from Free template from 与植物表达载体的重组 李静 111202019 * 抗植物病虫害基因 抗非生物胁迫、改良作物产品质量的基因 改变植物其他性状的基因及植物医药基因 植物基因工程中目的基因的分类 * * Free template from 载体（vector）是指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。 载体的定义 ①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制，且对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动 。 ②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入 。 ③含有复制起始位点，能够独立复制，通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失 。 载体的必要条件 ④有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。 ⑤载体DNA分子大小应合适，以便操作。　 * 载体的分类（一） 根据植物基因工程载体功能及构建过程，分四类型： 1 克隆载体：通常是由多拷贝的大肠杆菌质粒为载体，保存和克隆目的基因。 2 中间载体：包括中间克隆载体和中间表达载体 1）中间克隆载体：由大肠杆菌质粒插入T-DNA片段即目的基因，标记基因等构建而成。包括：中间粘粒载体，质粒/粘