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实验5 真核细胞RNA的制备和逆转录PCR-jghPPT
实验六 真核细胞RNA的制备及逆转录PCR;实验背景知识; RNA通常以单链形式存在，但也可形成局部的双螺旋结构。
RNA分子的种类较多，分子大小变化较大，功能多样化。;RNA的种类、分布、功能;* rRNA的种类（根据沉降系数）;RNA分离的最关键因素是尽量避免RNA酶的污染。创造一个无RNase的环境是提取RNA至关重要的因素。实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品都需特别处理。一方面避免外源RNase的污染。要做到如下几点：①操作戴口罩和手套；②实验室保持洁净；③玻璃器皿须用0.1%二乙基焦碳酸盐（DEPC）浸泡处理，并高压灭菌，250℃烘干4小时以上（高压不能完全灭活RNase）；④所有溶液（除Tris外）须经DEPC浸泡处理；⑤实验中所有塑料器材最好灭菌后一次性使用，所有化学试剂用新包装。另一方面排除内源RNase污染。内源RNase是由组织细胞中携带，细胞破碎后即释放出来。因而力争在提取的起始阶段对RNase活力进行有效抑制，主要方法是使用RNase抑制剂，常用的有盐酸胍、异硫氰酸胍、RNase阻抑蛋白（RNasin）和氧钒核糖核苷复合物等。
所有分离提取RNA的方案的第一步操作都是在能导致RNA酶变性的化学环境中裂解细胞，然后才将RNA从各种生物大分子中分离出来。决定采用何种合适的制备方法，取决于RNA的细胞来源及其最终用途。本实验介绍从真核细胞中提取总RNA的通用方法，细胞用异硫氰酸胍裂解，此过程操作较少，从许多来源都能获得纯净的RNA，是从高内源性RNA酶的组织中提取RNA的首选方法。 ;一、实验目的和原理;掌握逆转录聚合酶链反应的基本原理、实验基本条件 ;
熟悉PCR反应条件的优化和注意事项，PCR引物设计的基本原则，定量PCR的原理和用途。 ;二、实验材料;三、方法和步骤;四、注意事项; 逆转录PCR（RT-PCR） ;;;; 三．注意事项; 四．思考题;附：各种组织细胞RNA产量;;Thank You!
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