毕赤酵母表实验手册.doc

毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［］［］［］［］［］［］αA质粒，其信号肽来自酿酒酵母的α-交配因子（α-factor），能很好的达到以上的要求。并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有Zeocin抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利［］αA质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点简介如下： ⑴ 具有强效可调控启动子AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶）； ⑵ 具有Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选，即在YPDZ平板上生长的转化子中，100％都有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程［］αA的大肠杆菌转化子，不必另外使用Amp，经济而又简便；。 ⑶ 在表达载体A0X1 5’端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多克隆位点下游有A0X1 3’端终止序列； ⑷ 分泌效率强的信号肽α-factor. Invitrogen公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为广泛的酵母表达系统，其主要的优点有：醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高。外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在。同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且．有利于产物的纯化。 一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制 1．1 各种母液的配制 10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基） 4℃保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。 500*B （0.02%生物素 Biotin） 4℃保存 保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。 100*H （0.4%Histidine 组氨酸） 4℃保存 保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。 10*D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。 10*M （5%Methanol 甲醇） 保存期为2个月。将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。 10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。 100*AA （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸） 4℃保存 保存期为1年。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。 1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。 1.2 常用溶液及缓冲夜 1.2.1 碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液： 溶液Ⅰ：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L Tris－HCI (pH 8.0) 溶液Ⅱ：0.2mol／L NaOH，1％ SDS（临用时配制） 溶液Ⅲ：29.44g KAc，11.