第七章 植物原生质体培养PPT.ppt

第七章 植物原生质体培养与体细胞杂交Plant Protoplast Culture and Somatic Hybridization ;第一节 原生质体的用途 ;1.原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成、细胞膜的结构、大分子物质进出细胞过程与机理等问题的良好实验体系。 2. 转基因的良好受体：与外源DNA（如质粒）共培养时，原生质体可以直接吸收外源DNA，并整合到染色体上，从而实现对植物细胞的遗传转化，进一步通过植株再生就可得到转基因植物。;GFP质粒浓度对烟草原生质体转基因效率的影响;PEG介导的甜橙原生质体转GFP ;Tomato-potato hybrid;第二节 原生质体的分离;;一、??? 材料的选择;二、 酶解处理;CPW=Cell-Protoplast Wash Medium KH2PO4 27.2 mg/L KNO3 101.0 mg/L CaCl2·2H2O 148.0 mg/L MgSO4·7H2O 246.0 mg/L KI 0.16 mg/L Cu SO4·5H2O 0.025 mg/L ; 为了保持释放出来的原生质体的活力和膜稳定性，必须使原生质体处于一个等渗环境中。因此，酶解液中 必须加入渗透压调节剂。 常用的渗透压调节剂有葡萄糖、甘露醇和山梨醇等，浓度一般为0.35-0.8mol/L。具体用什么浓度，可根据材料的水势来确定。;2. 酶解：将植物材料放入酶解液中、释放出原生质体的过程。 叶片、幼茎和根等材料要切成小片； 叶片最好撕去下表皮。悬浮细胞要离心后再酶解。 材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶解液。 一般在25±2℃、黑暗中酶解，期间轻轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。酶解时间因材料而异，2小时~十几小时。 ;;三、原生质体的收集与纯化;苜蓿叶片原生质体的纯化;5. 收集原生质体：;完整的原生质体;四、原生质体活力的测定;FDA;第三节 原生质体培养; 在适宜的培养条件下，原生质体数小时后开始形成新的细胞壁，在显微镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、多边形等。约24-36h后，原生质体开始发生第一次分裂；以后随着细胞分裂，原生质体就形成细胞团， 进一步诱导出植株。;苜蓿原生质体分裂;6 weeks;苜蓿原生质体再生植株;转GFP基因的苜蓿原生质体再生植株;夜来香原生质体植株再生;4周;单倍体烟草原生质体培养与植株再生;杨树原生质体培养植株再生;杨树原生??体培养植株再生;杨树原生质体培养植株再生; 将含原生质体的培养液倒入培养皿底部，使其成一薄层，封口后进行培养。;特点： 操作简单，对原生质体的损伤小； 容易添加新鲜培养基和转移培养物； 原生质体分布不均匀，易发生原生质体之间粘连； 原生质体的位置不能固定，所以不能跟踪观察单个原生质体的生长过程。;2. 固体培养 （平板培养）;（1）液体浅层—固体平板培养双层培养法：培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。优点是固体培养基中的营养可以缓慢释放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂。; （2）琼脂糖珠培养：用移液管吸取含原生质体的琼脂糖培养基，滴在培养皿或三角瓶中，待其凝固后，再加入适量的液体培养基，进行旋转培养。也可以等含原生质体的琼脂糖培养基凝固后，用刀将其切成小块，再放入液体培养基中培养。 改进了培养物的通气和营养环境，从而促进可以促进原生质体的分裂及细胞团的形成。; 在培养过程中， 原生质体分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继续生长、分裂。待原生质体形成的细胞团（愈伤组织）达到1mm时，应将细胞团转移到新鲜的培养基上继续培养。所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈伤组织进行培养和植株再生。 ;;三、影响原生质体培养效果的因素;2.? 培养基;（2） 有机成分：同培养细胞、愈伤组织相比，培养原生质体时要求培养基有更丰富的有机成分，如氨基酸、维生素、CW，YE，LH，CH、小牛血清等。大量的结果表明，培养基中添加谷氨酰胺有利于原生质体的分裂。 （3） 激素：培养基中要加入一定浓度的细胞分裂素和生长素。由于2,4-D 促进细胞分裂能力很强，所以培养基中大都要加2,4-D。 （4） 条件化培养基：使用条件化培养基可以大大促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 ;（5）培养基中的渗