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第五章 基因芯片 * 生物芯片 可识别的有序点阵集合上，试样与每个点阵发生分子间反应或杂交后，通过扫描检测同时获得各个点阵上的作用信息。 * 按芯片固定的生物分子类型分类： 蛋白质芯片 基因芯片 芯片实验室 * 基因芯片技术 该技术系指将大量荧光标记的探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。 * 原理 1)将许多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作为靶基因，有规律地排列固定于支持物上； 2)样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子或放射性同位素作为探针； 3)按碱基配对原理将两者进行杂交； 4)通过荧光或同位素检测系统对芯片进行扫描，由计算机系统对每一探针上的信号作出比较和检测，从而得出所需要的信息。 * 一、芯片的制备 （1）支持物的预处理 载体材料要求： ①载体表面必须具有可以进行化学反应的活性基团，以便与生物分子进行偶联。 ②载体应当是惰性的和有足够的稳定性，包括机械的、物理的和化学的稳定性。 * 实性材料：硅芯片、玻片和瓷片,需进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。 膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜， 通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。 * （2）芯片制备方法 按制备方式分： 原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备的芯片。探针较短 DNA微矩阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活 * 原位合成芯片 1.显微光蚀刻技术 支持物表面活性基团连接有光敏保护基团（X）而受到保护。 产率较低 2.压电打印法 压电毛细管喷射器 产率较高 * 显微光蚀刻技术 首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来，选取适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其它部分不透光。 光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护，进而与单体分子共价结合。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。 因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。 优点： 合成效率高，点阵密度高 缺点： 设备昂贵，技术复杂，反应产率低 * 合成碱基单体的5’羟基末端连上一个光敏保护基，利用光照射使羟基端脱保护，然后逐个将5’端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。此方法的优点是合成循环中探针数目呈指数增长，在1.6cm2面积上合成40万组寡核苷酸。 * Light directed oligonucleotide synthesis.A solid support is derivatized with a covalent linker molecule terminated with a photolabile protecting group. Light is directed through a mask to deprotect and activate selected sites, and protected nucleotides couple to the activated sites. The process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each site. * 电压打印法 将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为40到50个碱基的探针。 优点： 设备廉价，技术相对简单，反应产率高 缺点： 点阵密度低，易产生交叉污染 * 合成程序 * DNA微距阵列 预先合成DNA或制备基因探针然后打印到芯片上 1.探针的制备 已克隆的基因片段 PCR，RT-PCR扩增的基因片段 人工合成的DNA片段 单链、双链DNA或RNA 均可作为探针 2. 打印 喷墨打印（非接触式点样） 针式打印（接触式点样） 3. 探针的固化 打印探针后，需