3—2016基因工程原理ds—测序技术.ppt

基因工程原理;第三章 测序技术;造福人类的HGP;第一节 DNA测序策略;一、已知序列的确证性测序策略;一、已知序列的确证性测序策略;（一）随机测序法;（二）定向测序法;（二）定向测序法;（二）定向测序法;（二）定向测序法;（二）定向测序法;Key Genomics Technologies;测序技术的发展;第二节 传统的DNA序列分析法;1970年发明了第一种DNA测序方法;Sanger双脱氧链终止法;一、基本原理;双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核苷三磷酸为测序反应的链终止剂。;*; P;在4组相互独立的测序反应体系中，分别加入四种不同ddNTP，其余成分相同。调整每个测序反应中dNTP与ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于待测模板DNA每个可能掺入的位置都有可能发生终止。 产生4组分别终止于互补链3′末端的每一个A、G、C和T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测，直接读出新合成DNA链的序列。;*;双脱氧链末端终止法测序原理示意图 ;二、测序反应体系的组成;Sanger双脱氧-M13体系;*;*;*;*;二、测序反应体系的组成;二、测序反应体系的组成;二、测序反应体系的组成;二、测序反应体系的组成;三、Sanger双脱氧链终止法的特点;Maxam-Gilbert DNA化学修饰法;由于这种化学切割反应的特异性是由碱基的修饰作用决定的，所以切割反应必定是定量的 化学切割反应的试剂： 肼 hydrazine 联氨 NH2-NH2 硫酸二甲酯 dimethylsulphate 六氢吡啶;碱性条件下，肼与胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（ C ）作用 通过六氢吡啶作用，使两个磷酸分子从糖片段上释放出来，导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂 盐存在的条件下，肼同T的反应被抑制，只发生胞嘧啶碱基特异的切割反应 由此区别C和C+T两种反应;硫酸二甲酯（(CH3O)2SO4） 一种碱性的化学试剂 作用于DNA碱基环中的氮原子，使之甲基化 在中性的pH值环境中，可导致配糖键发生水解，使去碱基的糖-磷酸键十分微弱 碱性条件下磷酸分子从DNA链上脱落，造成链的断裂 鸟嘌呤（G）的N7腺嘌呤(A)的N3 六氢吡啶作用，从脱氧核糖上移去2个磷酸分子，使DNA链在甲基化的鸟嘌呤G位点断裂;*;CS载体系统：末端标记载体 核酸内切酶Th111Ⅰ 特点： 产生5’单碱基的突出末端，便于标记； Th111Ⅰ位点十分稀少； 5’突出末端可以是G或A，也可以是T或C，选择性强； 在载体中具有两个Th111 Ⅰ位点，可对克隆在载体上的片段任何一段作选择性标记;化学修饰法的优点： 不需要体外酶切； 只要有末端标记，无论单双链都可用来测序。 限制因素：测序胶的分辨率;DNA杂交测序;*;两种操作方式： 1. 将不同的寡核苷酸与固定在滤膜上的靶DNA序列样品进行杂交 2. 应用寡核苷酸矩阵芯片的DNA杂交测序法;杂交测序的应用;毛细管电泳;（一）毛细管凝胶电泳CGE，Capillary gel electrophoresis 将平板电泳的凝胶移到毛细管中做支持物进行电泳，由于电场强度比板凝胶电泳大大提高，使分离时间缩短约25倍； 主要以聚丙烯酰胺凝胶作筛分介质，它黏度大、抗对流，能减少溶质的扩散，有极好的分离效果，除用于DNA序列分析外，还可用于DNA片段的分离和PCR产物的分析。 问题：制备凝胶柱费力；凝胶形成和电泳期间产生的气泡影响分离；使用过程中焦耳热对分离介质的降解使毛细管的寿命缩短等。;（二）非凝胶基质毛细管电泳 为了避免CGE存在的问题，非凝胶基质毛细管电泳用于DNA分析的研究越来越多； 非凝胶基质：线性聚丙烯酰胺和纤维素衍生物 非凝胶基质在DNA测序中可以更换，使毛细管的寿命延迟，在优化条件下可获得高效及高速的分离效果。;（三）阵列毛细管电泳CAE，Capillary array electrophoresis 将毛细管电泳与板凝胶电泳的优势相结合，采用毛细管凝胶电泳的装置，将多支毛细管并列进行分离与检测，以板凝胶电泳的优势弥补了毛细管凝胶电泳的不足，可一次检测多个样品； 阵列毛细管电泳散热效率高，适于高电场强度电泳，是一种高速、高通量的测序法； 使用非凝胶基质，毛细管壁可以抑制横向扩散，具有易于实现自动化的优点。;DNA序列分析的自动化;;测序仪原理;2.循环测序;377型遗传分析仪;第三节 第二代测序技术简介;Next Generation Sequencing;表 目前使用最广泛的三大第二代测序平台测序能力统计信息（2010年年初数据）;Roche 454 焦磷酸测序;原 理;*;测序原理;测序原理;工作流程;工作流程;工作流程;工作流程;454 sequencing： Emulsion PC