TALEN及CRISPER基因靶向技术.pptxVIP

2013,11,13 划时代的靶向基因操作技术- TALEN和CRISPR/Cas9 Outline Background Transcription activator-like (TAL) effector CRISPR/Cas9 我们研究一个作物的性状，最终都需要做一件事：改变基因，从必要性和充分性两方面阐明基因功能。 1）Loss function：降低基因或删除基因 Give function: 提高基因的表达 Background 生物学家的梦想：随心所欲地操作基因 划时代的基因靶向操作技术： TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦 我们不再大海捞针！！！ 经典基因操作： Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！ 3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。 4.充满梦想却幻灭的ZFN： 难以完全找到匹配的3连子锌指； Off-target 严重。 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target” 5.完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶 TALEN技术形成的关键研究 Sugisaki Hiroyuki Jens Boch 发现FokI核酸酶 破译TALE序列 （1981） （2009） Daniel F. Voytas Adam J.Bogdanove 将TALE DNA结合motif与FokI核酸酶融 合，推出与ZFN同类型的双链DNA剪刀， 称之为TALEN。(2011) TALE的发现迅速成为科技最前沿 TALE domain: DNA 识别域 TALE，植物病原体黄单胞菌 Xantomonas – 用于调控宿主基因 由34 个氨基酸长度的重复单位构成 第12，13位点氨基酸（ repeat-variable di-residue，RVD）不同 RVD决定识别位点不同 Nuclease domain: DNA剪切域 FokI，发现于海床黄杆菌 Flavobacterium okeanokoites 采取其非特异性DNA剪切结构域 形成二聚体时发生剪切 N’ C’ TALE FokI LTPDAVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHG NI → A HD → C NG → T NN → G A T T C T G C T A A C T C A T A C TALEN核酸酶 DNA 识别域 DNA剪切域 FastTALETM连接TALEN N’ C’ N’ C’ TALEN modules at 9 positions TALEN backbone vectors TALEN assembled vectors Promoter FokI Promoter FokI x4 x16 x4 x16 x4 x16 x4 x16 x4 x16 x4 x16 x16 x16 x4 x16 Position 1 Position 2 Position 3 Position 4 Position 5 Position 6 Position 7 Position 8 Position 9 1/2 9 x 16 dimers, 7 x 4 monomers Complete library: 172 CMV, EF1a, Ubi, 35S, T7, SP6 Maximum RVDs: 19 Minimum RVDs: 12 一步连接 只要4-5小时，这些片段就全部连接 亚克隆到植物表达载体上 通过Ti载体介导转染插入植物基因组中，然后表达目标蛋白-TALEN，TALEN剪切DNA，造成突变体。最后通过交配将TALEN去除，达到无痕基因敲除的目的。 We targeted the rice bacterial blight susceptibility gene Os11N3 (also called OsSWEET14) for TALEN-based disruption. This rice gene encodes a member of the SWEET sucrose-efflux transporter family and is hijacked by X. oryzae pv. oryzae, using its endogen