ppt课件-western blot 技术原理及常见问题分析-2014.pptxVIP

Western blot 技术原理及 常见问题分析;Western Blot简介及原理 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析;Western Blot 简介：;Western Blot 基本原理;Western Blot 优点;Western Blot应用;蛋白表达分析-定性;蛋白表达分析-相对定量;蛋白表达分析-绝对定量;proA;Western Blot 流程;蛋白样品的变性;SDS(十二烷基硫酸钠 )：;不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。 ;凝胶成分;凝胶浓度与蛋白分离范围;灌制分离胶 隔绝空气;灌制浓缩胶 插入梳子 ;; 1 2 3 M;转膜;转移膜的选择;湿转系统;半干转印系统;转膜后检测（此步可以省略）;封闭;一抗、二抗孵育;不同标记的二抗及成像方法大PK;酶标抗体 ：如HRP（辣根过氧化物酶）、AP（碱性磷酸酶）等 成像方法：加酶的底物产生化学发光反应 ;; 显色反应：HRP敏感物TMB，CN，DAB等底物 优点：方便、便宜，直接成像 缺点：有毒、灵敏度较低、背景高、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 ;;; 化学发光显色：目前使用最多的方法 标HRP二抗加ECL底物化学发光反应 优点：灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、 特异性高、可重新剥离检测 ;灵敏度：MicroChemi ≥胶片曝光 ;;压片实例;压片：无法准确获得目的条带的大小，只能固定胶片位置在胶片上标出Marker的大概位置;CCD成像 动态范围大，能直接叠加Marker，便于后期图像的处理及分析; 特推荐东胜创新经营DNR公司MicroChemi化学发光检测系统，灵敏度高，操作简便功能齐全，价格实惠 产品特点：;其他成像方法示例;Western Blot结果分析;Western Blot常见问题分析;SDS电泳;条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？ 条带微弱？;转膜及抗体检测;转移到膜上的蛋白很少;膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体浓度过高;杂交信号很弱或没有;一抗不是唯一特异的 二抗出现非特异结合;谢谢大家！ 也欢迎大家与我共同讨论和学习！ chunjuan_miao@