膜片钳的基本原理与应用2012年临床麻醉监测技术进展学习班讲稿.ppt

美国FDA规定，有关抗心率失常药物的申报必须有膜片钳的相关实验数据，膜片钳已成为抗心率失常药物筛选的金标准。Ⅲ类抗心率失常药物的寻找是当前心血管药物研究的重要方向，其作用特点是抑制瞬时外向钾电流、内相整流钾电流等多种钾离子通道，使动作电位时程（APD）延长，减慢兴奋的传导，降低心肌细胞兴奋性，从而发挥短期抗心律失常作用。各种K通道被抑制均可使APD延长，要单独观察药物对某一种钾电流的作用，并与其他K电流的影响相区别，普通的电生理实验是难以实现的，在这方面膜片钳有其独特的优越性。 药物筛选 突触后电流是神经元之间是否形成突触联系的特异性电生理指标。 神经干细胞移植已成为修复损伤或退行性病变的中枢神经系统的新的治疗手段，移植的干细胞要发挥治疗作用最根本的是要能和其他的正常的神经元发生功能性的联系。通过突触素及电镜的观察表明，神经干细胞和原代培养神经元体外共培养，二者能发生形态上的突触连接，通过记录突触后电流，证实二者也能发生功能性的联系，至于干细胞体内移植，他和其他神经元能否发生功能性的突触连接有待进一步研究。 突触联系、突触传递的研究 长时程增强（LTP）是评价学习记忆及其突触可塑的常用的电生理指标 海马脑片实验己经广泛用于学习记忆方面的研究，利用膜片钳技术记录脑片LTP，可在细胞水平研究学习记忆的机制 研究结果大致可概括为，一些影响LTP的因素确实对学习研究过程产生明显的影响，一些影响学习过程的因素也影响LTP形成。诱导海马脑区的LTP形成可提高学习记忆活动，学习过程中伴有海马脑区LTP的形成。 突触可塑、学习记忆及其机制的研究 离子通道结构和功能的异常可导致离子通道病，人类许多疾病都是由于各种离子通道的功能障碍所造成的，常常累及人体多个系统，目前已经发现至少有几十种离子通道参与离子通道疾病的发生，根据病因，大致可分为几类： 疾病机制研究 如癫痫是由于患者脑组织病灶中的神经元同时去极化，产生高频、同步、爆发式放电并向周围扩散，导致更广泛的脑组织兴奋，引起癫痫发作。研究发现，高热惊厥癫痫综合症患者的第19号染色体上的基因发生了突变，而这个突变的基因正是电压依赖性钠通道β1亚基的基因。β1亚基调节通道的开关速率，突变导致亚基上的一个氨基酸发生了改变，使钠通道的开关速率变慢，神经元的去极化时间延长，钠依赖性动作电位不断形成引发癫痫。 （1）离子通道基因编码区突变，导致离子通道功能亢进或降低 如细胞内钙在淋巴细胞的增殖、分化、IL-2的分泌及受体的表达等方面起作重要作用，淋巴细胞膜上K（Ca）通道对细胞内钙的调节起作重要作用，研究表明，K通道阻断剂阻断此通道后，淋巴细胞的分裂增殖及IL-2的合成明显受到抑制。K（Ca）开放引起大量K外流，使细胞膜超级化，对Ca离子内流的驱动力增大，使[Ca]i增加， [Ca]i又使K（Ca）通道活化，导致[Ca]i增加。 （2）通道调节能力缺陷： 如重症肌无力，是一种神经肌肉终板部位突触后膜上AChR减少而出现传递障碍的自身免疫性疾病，有家族史，与遗传密切相关。骨骼肌细胞AChR通道出现抗体，导致AChR功能障碍，以骨骼肌的渐进性疲劳和延及全身的虚弱为特点。 （3）产生自身抗体 如B淀粉样蛋白可在神经元膜上形成大的非选择性离子通道，该通道可通透Ca离子，这可能是老年性痴呆疾病中神经原受损的原因之一。 （4）形成新的离子通道而产生疾病 几乎所有细胞的脂质双层膜其电容均为1μF/cm2 ，因此通过测定膜电容可精确反映细胞表面积的变化。当分泌囊泡与细胞膜融合后，其囊泡膜会增加到细胞膜上而使细胞膜的表面积增大；而当分泌囊泡经胞饮作用从细胞膜上退出后，则会使细胞膜的表面积减少，因此通过对细胞膜电容的监测可以反映细胞的分泌活动及其机制，另外，膜融合产生的一过性电流也可记录到。 细胞的胞吐与胞吞功能测定 膜片钳技术是一个应用非常广泛的电生理技术，它不仅用来记录离子通道的电活动，膜片钳电极本身还有许多非电生理学方面的应用，与其它生物学方法的结合应用目前已经非常普遍。 膜片钳在其他方面的应用 Ca2+是重要的信使物质；测定胞内钙浓度的改变十分重。钙荧光指示剂法应用最广泛的, 在胞内, 酯形式指示剂被非特异性酯酶水解, 重新与Ca2+ 结合，在340nm～ 380nm 的荧光强度比值能够很好的反映Ca2+ 浓度。 利用膜片钳的全细胞技术，将荧光探针直接导入细胞，或将胞内的荧光探针抽吸稀释掉，从而测定细胞器（线粒体，内质网等）内的游离钙浓度。 膜片钳和钙成像技术联合应用在测定细胞内游离Ca2+离子同时检测离子通道的功能改变。 膜片钳和钙成像技术的联合应用 前面介绍的膜片钳和钙图像技术的联合应用测定细胞内钙只适用于单个的细胞，而利用这种方法测定脑片上单一神经元的离子浓度比较困难，原因在于在脑片上一个神经元的胞