刘士东主任讲解分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用PPT课件.pptVIP

免疫组化（－）与FISH扩增阳性 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC：－ FISH：呈簇状扩增 肿瘤细胞不着色 ×40 ×100 基因突变检测方法 1.RNA酶A切割(RnaseAcleavage) 2.变性梯度凝胶电泳(DGGE) 3. 杂合双链分析法(HA) 4. 化学切割错配(CCM) 5.碳化二亚胺检测(Carbodiimide,CDI) 6.酶促切割错配(Enzyme Mismatch Cleavage, EMC) 7.单链构象多态性 (Single-Strand Conformation) 8.切割片段长度多态性 9.DNA测序(Sequencing) 10.双脱氧指纹图谱法(Dideoxy Finger-printing, ddF) 11.错配接合蛋白检测 12.蛋白截短测试（protein truncation test） 方法 13.变性的高效液相色谱检测(Denaturing High Performance Liguld Chromatography DHPLC) 14.DNA芯片技术(DNAchip) 15.等位基因特异性扩增 16.等位基因特异性寡核苷酸片段分析(Allele-Specific Oligonucleotide,ASO) 17.引物延伸检测(Primer Extension,PEX) 18.寡核苷酸连接检测(Oligonucleotide Ligation Assay,OLA) 19.限制性片段分析(Restriction Fragment Analysis） 20.突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR） 21.蝎形探针扩增阻滞突变系统（Scorpions amplification refractory mutation system） 肺癌组织EGFR基因扩增和突变检测及其临床意义 研究背景 研究显示吉非替尼对部分晚期NSCLC患者的治疗效果非常显著。 存在EGFR基因突变的患者更有可能对吉非替尼的治疗敏感。 存在EGFR基因扩增的肺癌、肠癌病人对分子靶点药物更为敏感。 检测大肠癌有无EGFR过度表达，只要1%的癌细胞的胞膜强阳性染色即判断为3+，可作为应用西妥昔单抗的指征。 FISH检测EGFR基因扩增 标本类型：石蜡包埋组织（手术、活检、穿刺） 冰冻组织 胸、腹水沉渣细胞 探针类型：GLP EGFR / CSP7 定量PCR检测EGFR基因突变分型 突变类型： 19 exon （2235-2249位点）15bp缺失突变 19 exon （2240-2257位点）18bp缺失突变 19 exon （2240-2251位点）12bp缺失突变 21 exon 2573位点TG碱基置换突变 21 exon 2582位点TG碱基置换突变 EGFR基因变异检测 双体性 三体性 多体性 扩 增 EGFR基 因 FISH 检 测 状 况 肺癌石蜡 FQ-PCR分型技术检测EGFR突变 存在EGFR突变肺癌样本的琼脂糖凝胶电泳图 71例肺癌组织中检测出6例突变样本 FQ-PCR 检测15bp缺失阳性病例结果 红色阈值线以上的扩增曲线即为阳性标本的扩增曲线，按荧光信号值的高低依次为 9号、12号、13号、55号、38号和33号标本 15bp缺失突变型DNA的测序图 sense antisense 红色阈值线以上的扩增曲线即为阳性标本的扩增曲线，按荧光信号值的高低依次为2号、36号、和40号标本 FQ-PCR 检测18bp缺失阳性病例结果 目前K-RAS突变检测常用技术 方法 直接测序 焦磷酸测序 高分辨率熔解曲线 PCR-RFLP 芯片 杂交 Real-Time PCR 肿瘤组织的确认和筛选 显微切割肿瘤 提取DNA 相应的PCR反应或杂交 相关的分析和检测 K-ras突变检测基本流程图 直接测序(Direct Sequencing) PCR扩增后产物直接测序 双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法) DNA 片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测 K-ras突变检测结果 疗效预测标志物与预后判断标志物 疗效预测标志物： 能够预测某种特定治疗方式疗效的标记物 KRAS基因突变导致肿瘤对EGFR抑制剂抵抗 预后判断