但对于进展期大肠癌患者 中国临床康复中国组织工程研究与临床康复课件.pptVIP

逯晓波 中国医科大学公共卫生学院 材料与方法 细胞系 中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）: AA8（CHO野生型） UV20（CHO 突变型，ERCC1表达缺失） DMEM培养基， 37℃,5% CO2培养箱中培养备用。 方法: 构建两种包含ERCC1 codon 118 SNP 的基因型T/T或C/C的质粒 总RNA提取及 cDNA合成 PSQTM DNA短序列分析ERCC1SNP基因型 ERCC1基因扩增及目的片段的回收 Gateway?定向克隆技术构建ERCC1表达载体 2、不同ERCC1 SNP的表达载体转染UV20细胞 转染细胞可在含10% G418 的DMEM培养基选择 生长，次日调G418 浓度为5%，五日后，在荧光 显微镜下根据是否可见表达绿色荧光蛋白细胞， 确定是否转染成功及转染效率。 每次转染实验设立无DNA的空白对照组，以保 证实验结果的特异性 3 、蛋白提取及Westernblot检测ERCC1表达 获得3种稳定转染细胞系UV20-ERCC1(C/C)或 UV20-ERCC1(T/T)及UV20-GFP,聚丙稀凝胶电 泳法定性检测ERCC1蛋白表达 4 、 检测各转染细胞ERCC1mRNA水平 实时-定量PCR法 5、PSQTM DNA短序列确定转染细胞基因型 6、SRB法测定草酸铂的细胞抑制率 7、细胞克隆实验分析草酸铂细胞毒性 8、改良彗星实验检测草酸铂所致DNA损伤 9、Rad51免疫荧光实验评价草酸铂所致DNA损 伤及修复 结果 1、ERCC1入门载体及表达载体的构建、酶切鉴 定及测序分析 ERCC1入门载体pDONR-ERCC1(3150bp)可选择生长于含1%卡那霉素培养基平板，质粒纯化后，用PstⅠ进行限制性酶切，得到533 bp和2617 bp的预期片段。 ERCC1表达载体pIRES-GFP-ERCC1(6626 bp) 可选择生长于含1%氨苄青霉素培养基平板经HindⅢ酶切后可获1227bp,5039bp片段,而经BglⅡ酶切后可获891bp,5735bp片段。 2、ERCC1在UV20细胞中的表达 3、Westernblot验证ERCC1在各细胞系中表达 4、转染细胞ERCC1的SNP确定 5、不同细胞ERCC1 mRNA水平比较 6、草酸铂的细胞抑制率测定及细胞克隆实验结果 7、 改良彗星实验测定各细胞DNA损伤修复程度 讨论 ERCC1基因存在着两个常见的单核苷酸多态性 有报道认为ERCC1codon 118 SNP 拥有T/T基因型的卵巢癌细胞系与ERCC1mRNA水平降低相关,有人将ERCC1 codon 118 19007TC SNP作为判断草酸铂治疗进展期肠癌疗效的一个遗传预测标记。但与此相反，通过对31例进展期肠癌分析数据发现，T/T基因型的出现频率与肿瘤组织内高表达的ERCC1水平相关。可见有关ERCC1 codon 118 C/T是否影响ERCC1基因表达，从而影响铂类药物的敏感性尚无定论。本研究发现该SNP并未引起ERCC1蛋白表达水平的改变，未见细胞群体水平的细胞抑制率发生改变，也未见细胞个体水平的DNA修复损伤能力产生差异。 本研究下一步工作的重点将继续探讨ERCC1 8092CA多态对于ERCC1mRNA水平的影响、阐明ERCC1 8092CA对于ERCC1 codon 118 SNP的作用以及ASE-1的基因功能。 * * ERCC1 codon 118单核苷酸多态性与 草酸铂敏感性的关联性研究 前言 大肠癌是世界范围内发病及死亡率较高的恶性肿瘤。近年来我国的大肠癌发生率也呈逐年上升趋势。遗传、饮食、肠道内微生态失衡等因素可能与其发生、发展密切相关。早期治疗的大肠癌一般预后良好，但对于进展期大肠癌患者，大多数治疗效果不尽人意。故探求新的有效治疗手段对挽救进展期大肠癌患者生命和提高生存质量具有重要意义。 草酸铂（Oxaliplatin）是新一代铂类抗肿瘤药物，具有抗癌谱广，毒副作用小等优点，尤其可以用于有效治疗进展期大肠癌。然而由于临床用药的盲目与滥用，无论单独还是联合应用，草酸铂的目标有效率也仅为20%-35%。因此，提高草酸铂使用的有效性及安全性，降低耐药性的相关研究逐渐受到普遍关注。 铂类药物的细胞毒作用主要归因为铂原子与细胞内DNA特异位点结合形成的铂-DNA加合物产生链间交联或链内交联，抑制DNA复制转