QS2631内切-β-1,4-葡聚糖酶(Cx)活性测定试剂盒说明书.docVIP

货号：QS2631 规格：50管/24样 内切-β-1，4-葡聚糖酶（Cx）活性测定试剂盒说明书 分光光度法 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： Cx存在于细菌、真菌和动物体内，是纤维素酶系的组份之一，Cx主要作用于非晶态纤维素和水溶性纤维素衍生物，随机水解糖苷键，将其分解成葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和其他 寡聚体。 测定原理： 采用3,5－二硝基水杨酸法测定Cx催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 15mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：液体 60mL×1 瓶，4℃保存； 样品测定的准备： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 3、血清（浆）样品：直接检测。 测定步骤： 1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。 2、加样表（在 EP 管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL） 对照管 测定管 样本 50 50 试剂一 500 蒸馏水 500 混匀，37℃准确水浴 2h 试剂二 1000 1000 混匀， 90℃水浴 10min（盖紧，防止水分散失），冷却后，测 540nm 下吸光值 A，计 算 ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。 Cx 活性计算 1、标准条件下测定回归方程为y=6.4078x-0.0673；x 为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。 2、血清（浆）Cx 活力的计算 单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 Cx 活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V 反总]÷V 样÷T =14.305×(ΔA+0.0673) 3、细胞、细菌和组织中 Cx 活力的计算 （1）按照蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 Cx活力(μg/min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673)÷6.4078×V反总]÷(V样×Cpr) ÷T =14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr （2）按样本鲜重计算 单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 Cx 活力(μg/min/g 鲜重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷(W×V样÷V样总) ÷T=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W （3）按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 Cx 活力(μg/min/104cell)=[1000×(ΔA+0.0673)÷6.4078×V反总]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.0286×(ΔA+0.0673) 1000：1mg/mL=1000ug/mL；V 反总：反应体系总体积，0.55mL； V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，120 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。 第1页，共2页