A549DDP细胞凋亡和其机制的研究.docVIP

A549/DDP细胞凋亡及其机制的研究 1材料 1.1主要仪器 荧光显微镜及照相系统：Olympus公司 垂直电泳槽：Bio-Rad公司 电转移槽：Bio-Rad公司 恒温摇床：江苏太仓仪器公司 分光光度仪：Bio-Rad公司 遥控酶标仪：TECAN公司 台式高速离心机：eppendorf公司 其余同前两部分 1.2普通耗材 50mL/250mL细胞培养瓶：Nunc公司 6孔细胞培养板：Costar公司 60mm细胞培养皿：Costar公司 细胞刮刀：Nunc公司 1.3主要试剂 Hoechst33258染色试剂盒：碧云天公司 PI和Annexin V-FITC：美国BD公司 TUNEL试剂盒：罗氏公司 鼠抗人Caspase-8 p10单抗：Cell Signaling HRP标记羊抗鼠二抗：武汉博士德公司 BCA法蛋白定量试剂盒：Pierce公司 ECL发光检测试剂盒：Pierce公司 硝酸纤维素转移膜(0.22μm)Amersham公司 DAB北京中杉公司 其余试剂同前两部分 1.4常用缓冲液及培养基 结合缓冲液(×10)： 100 mmol/L HEPES(PH 7.5) 1.4 moL NaCl 25 mmol/L CaCl2 单去圬剂裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0) 150 mmol/L NaCl 1%TritonX-100 100 g/mL PMSF 5×SDS蛋白上样缓冲液： 250 mmol/L Tris-HCl(PH 6.8) 10%SDS 50%甘油 0.5%溴酚蓝 500 mmol/L DTT(临用前现加) 电泳缓冲液： 25 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4) 250 mmol/L甘氨酸(PH 8.3) 0.1%SDS 转移缓冲液： 5.6 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4) 120 mmol/L甘氨酸 0.1%SDS 20%甲醇(V/V) 储存于4℃备用 PBS缓冲液 137 mmol/L NaCl 2.7 mmol/L KCl 10.0 mmol/L Na2HPO4 2.0 mmol/L KH2PO4 调节至PH=7.4 洗涤缓冲液(PBS-Tween-20)： 1000 mL PBS(PH7.4,0.01M) 500μL Tween-20 封闭缓冲液： 5 g脱脂奶粉 100 mL PBST 1.5细胞系 同第一部分 2方法 2.1 A549/DDP细胞凋亡的检测 2.1.1细胞凋亡形态学观察 将A549/DDP细胞分别加入到含盖玻片的6孔细胞培养板中，每孔细胞数为1×104个，培养过夜后，去培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液继续培养24 h后终止培养，取出细胞爬片，按照Hoechst33258染色试剂盒说明书进行染色。 ①在细胞爬片上，轻轻滴加约500μL固定液，以刚覆盖爬片为宜，固定10分钟。 ②去固定液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。 ③加入0.5mLHoechst33258染色液，染色5分钟，用手晃动数次。 ④去染色液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。 ⑤滴加一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片剂，避免气泡。 ⑥上荧光显微镜观察，激发波长350nm，发射波长460nm。 2.1.2原位末端标记(TUNEL)染色 同上方法制备细胞爬片，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定后，按照TUNEL 试剂盒说明书操作。 ①在细胞爬片上，轻轻滴加约500μL固定液，以刚覆盖爬片为宜，固定30分钟。 ②PBS洗片两次，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。滴加内源性过氧化物酶阻断剂(0.3%H2O2-甲醇溶液)，室温孵育30分钟。 ③同上用PBS洗片，滴加通透液(0.1%TritonX-100溶于0.1%枸橼酸钠溶液中)，在冰浴中孵育2分钟。 ④PBS洗两次，滴加50μL的TUNEL反应混合液，湿盒中室温孵育60分钟。 ⑤PBS洗两次，滴加50μL的转化剂-POD，湿盒中37℃孵育30分钟。 ⑥PBS洗两次，加入DAB底物溶液，室温孵育10分钟。 ⑦PBS洗两次，封片。光镜下观察。 ⑧结果判定：细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性。每张片至少观察500个细胞，计算每100个细胞内的阳性细胞，即凋亡指数(apoptotic index,AI)。 2.1.3流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡 ①取对数生长期A549/DDP细胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液。 ②接种于直径60mm培养皿中，每孔4mL，细胞培养箱中过夜培养。 ③次日吸弃原细胞培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液，继续培养24h。