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变性梯度凝胶电泳 DGGE 和温度梯度凝胶电 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE) 2011年04月28日 　　实验原理： 　　变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是 Lerman 等人于20 　　世纪 80 年代初期发明的，起初主要用来检测 DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在 1993 年首次将其应 　　用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel 　　electrophoresis，TGGE）。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已 　　经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。 　　变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)分析PCR产物，如果突变发生在 　　最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。变性梯度凝胶电泳法 　　原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳 　　迁移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程 　　度而被分离。由于变性梯度凝胶电泳法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置， 　　合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。 　　DGGE变性梯度凝胶电泳主要应用于环境样品细菌、古细菌、真菌、真核微生物的多样性分析（土壤、水等 　　样品无需培养，直接提取DNA扩增检测）动、植物体内外共生微生物的检测；食品微生物的检测；医学领 　　域碱基突变的检测，杂合子检测等等。 　　实验流程： 　　DNA样品的提取→ PCR扩增→ DGGE电泳→ 带型分析→ 特征条带的测序 　　原理： 　　双链 DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的 　　DNA 片段能够被区分开，但同样长度的 DNA 片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE/TGGE 　　技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同 　　样长度但序列不同的 DNA 片段区分开来。一个特定的 DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了 　　其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) 。一个几百个碱基对的 DNA 片段一般 　　有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当温度逐渐升高（或是变性剂浓度逐渐增加） 　　达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当温度再升高依次达到各其他解链 　　区域温度时，这些区域也依次发生解链。直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解 　　链，从而双链 DNA 完全解链。不同的双链 DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区 　　域的解链温度也是不一样的。当它们进行 DGGE/TGGE 时，一开始温度（或变性剂浓度）比较小，不能使 　　双链 DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而 　　一旦 DNA 片段迁移到一特定位置，其温度（或变性剂浓度）刚好能使双链 DNA 片段最低的解链区域解链 　　时，双链 DNA 片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的 DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。 　　因此，同样长度但序列不同的 DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它 　　们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。然而，一旦温度 　　（或变性剂浓度）达到 DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，成为单链 DNA 分子，此 　　时它们又能在胶中继续迁移。因此如果不同 DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就 　　不能被区分开来。在 DNA 片段的一端加入一段富含 GC 的 DNA 片段（GC 夹子，一般 30-50 个碱基对） 　　可以解决这个问题。含有GC 夹子的 DNA 片段最高的解链区域在 GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很 　　高，可以防止 DNA 片段在DGGE/TGGE 胶中完全解链。当加了 GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处 　　的序列差异都能被区分开。当用D