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高通量测序文库构建 Contents1.基因文库的定义基因文库的类型2.捕获测序文库构建3.免疫组库测序文库构建4.基因文库是什么一 基因文库 经典定义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。基因文库包括DNA文库，RNA文库和质粒文库。 海量基因 间隔序列 基因难直接分离为什么要构 建基因文库 调控序列 单个基因表达量低 非编码序列 重复序列 二 基因文库类型 其他文库DNA文库RNA文库2.1 DNA文库 二双末端测序文库单末端测序文库DNA大片段文库序列靶向捕获文库单细胞基因组测序文库DNA-seq实验流程图MALBAC法2.2RNA文库12345降解组测序文库构建 普通RNA文库构建链特异RNA文库构建小RNA文库构建单细胞RNA组测序文库构建RNARNA-seq实验流程图 首先，我们获得细胞总RNA，然后根据实验需要，比如是需要测mRNA，ncRNA还是smallRNA等，对RNA样品进行处理。处理 好的RNA再进行片段化，然后反转录形成cDNA，获得cDNA文库，然后在cDNA片段的两端接上接头，最后用新一代高通量测序依进行测序。链特异性RNA文库主要用于lncRNA测序，circRNA测序Small RNA是一类长度在20-30nt重要的体内调节分子，主要包括miRNA、piRNA和siRNA。Small RNA测序技术采用胶分离技术，收集样品中18-30nt或18-40nt的RNA片段，利用高通量测序技术，一次性获得单碱基分辨率的数百万条小RNA序列信息。三 序列捕获测序 序列捕获测序，是将感兴趣的基因组区域定制成特异性探针与基因组DNA进行杂交（固相或液相），将目标基因组区域的DNA片段进行富集后再利用第二代测序技术进行测序。主要有外显子捕获和特定基因区捕获。主要用于孟德尔疾病，肿瘤，个体化用药和复杂疾病靶向安捷伦芯片片段大小：150-200bp测序平台： Illumina HiSeq、 MiSeq 实验周期：2天NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library使用高密度探针的方法，主要是利用杂交和 DNA 微阵列技术基因分离原理来捕获目标区域。Illumina芯片片段大小：150bp实验周期：2.5天四免疫组库测序免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。免疫组库测序（Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ)）是以 T/B 淋巴细胞为研究目标，用多重PCR技术扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性的互补决定区（CDR3区），再结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系。通过生物信息学方法分TCR/BCR的多样性和丰度，可以得知人体对感染，疫苗，和治疗的免疫反应状况。靶向Immuno-Seq技术可以观察和分析T细胞和B细胞，达到前所未有的深度和特异性。在疾病监控，抗体生产，疫苗研究，健康体检和免疫治疗等领域有广泛的应用。现在临床上有许多种检测可以监控你的健康状况，但是却没有一种被广泛接受的方法可以检测你免疫系统的各个方面。我们怎么可以得知一个人的免疫系统是很强健还是很虚弱？在人们受哮喘，过敏，关节炎折磨时，如何量化免疫系统的错误？斯坦福大学的一个研究团队在开发这样的检测方面迈出了第一步，他们的方法是：给免疫系统“拍照”。There are numerous tests to gauge the health of your heart. But no such widely accepted test exists for the many parts of the immune system. How can we tell if the immune system is strong or weak? Or quantify how badly it’s malfunctioning when we suffer from asthma, allergies, or arthritis?------Francis Collins, NIH Director 2013年2月13日 免疫系统每个成熟的T细胞（B细胞）表达一个单一的特异性TCR（BCR）的针对有限数量的抗原。T cell receptorGenomic DNATPBMCBlood sampleCD8RNAPatient TissuesSingle cell SuspensionAmplify the library by