重组子的筛选与鉴定PPT课件.ppt

③ 新霉素抗性基因--neor 细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活。 G418 真核细胞 死亡 G418 存活 neor 真核细胞 含致死剂量G418的完全培养基。 ① G418培养基 真核细胞株均可。 neor基因。 ②宿主细胞 ③载体标记 （2）选择过程 G418：（100-800?g/mL） CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化氯霉素发生乙酰化失活。 氯霉素 cat 含氯霉素的完全培养基。 真核细胞株均可。 cat基因。 乙酰氯霉素 4. 氯霉素乙酰转移酶（CAT） （1）选择原理 （2） 选择条件 （3） 宿主细胞 （4）载体标记 chloramphenicol acetyl transferase 在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。 （5） CAT分析方法 ② 免疫学检查： 用抗CAT的血清进行Western blot或ELISA，检查CAT的表达。 Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen. Other kits to assay for CAT protein using ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemicals and Molecular Probes. ① 分析乙酰氯霉素 二、植物转化体报道基因筛选法 （1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。 1. 报道基因（reporter gene) （4）其它 2. 几种报道基因的作用原理 4-甲-β-D-葡糖醛酸 荧光产物 GUS GFP 紫外光照 发绿色荧光 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸 蓝色水解产物 GUS Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP 转入萤火虫的luciferase的烟草 烟草叶片表达B型肝炎抗原 植物细胞中适用的报道基因 酶活性 是否显性 方法是否成熟 新霉素磷酸转移酶 显性 成熟 潮霉素磷酸转移酶 显性 成熟 二氢叶酸还原酶 显性 成熟 氯霉素乙酰基转移酶 显性 成熟 庆大霉素乙酰基转移酶 显性 成熟 胭脂碱合成酶 隐性 成熟 章鱼碱合成酶 隐性 成熟 β-D-葡萄糖苷酶 隐性 成熟 链霉素磷酸转移酶 显性 成熟 萤火虫荧光素酶 隐性 成熟 细菌荧光素酶 隐性 成熟 苏氨酸脱氢酶 显性 成熟 磷酸肌醇乙酰转移酶 显性 成熟 乙酰乳酸合酶 显性 不成熟 绿色荧光蛋白 显性 成熟 Bromoxynil 硝化酶 显性 不成熟 5-enolpyruvylshikimate-3磷酸转移酶 显性 成熟 核酸杂交检测方法 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 1. Southern blotting 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。 只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。 酶切前 酶切后 插入片断 载体 Southern blot 筛选结果 * * ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis） 在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。 电泳buffer 电泳buffer 点样 电泳方向 ③蛋白质电泳的分子量标准 已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。 商品化供应 Da 道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为6×1023道尔顿 Dalton SDS PAGE ④凝胶中的蛋白质染色： 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1μg/带，但可褪色回收。 硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。 2）转到膜上进行染色。 1）直接染色 直接染色电泳结果 （2）Western blotting 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。 ① Western（转膜） 胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。 膜 胶 蛋白 Western装置 ② Blotting 原理与ELISA相同。 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 辣根过氧 化物酶 底物 产物， 并发出光 PAGE胶 待测蛋白 底片曝光 辣根过氧化物酶：HRPO 1）先用一抗（待