实时荧光定量PCR的原、操作及其应用.pptVIP

二、操作及结果分析 8.熔解曲线分析 二、操作及结果分析 9、操作流程 确立实验方案 样品制备 设计引物及探针 预实验 标准品及标准曲线的建立 定量PCR检测 分析数据 三、荧光定量PCR技术的应用 1、绝对定量分析 这是荧光定量PCR技术的直接应用，可用于检测病毒及细菌的浓度！ 三、荧光定量PCR技术的应用 2、相对定量分析及实验方案 基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子. 遗传物质DNA首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA（mRNA）,携带遗传信息的mRNA从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。 三、荧光定量PCR技术的应用 2、相对定量分析及实验方案 研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。基因表达调控研究中，由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。所谓的看家基因即内参基因，是指在各生理阶段表达量恒定的基因，也称奢侈基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作参照，常用的内参基因有GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基因等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。 假定在1生理时期，X基因的表达量为X1；其内参基因表达量为Y1；X1/Y1就将1生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；同样在2生理时期，X2/Y2就将2生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；最后（X1/Y1）/（X2/Y2），所得的值就能就能较为真实的反应在1、2生理时期，X基因的变化情况。 常用的相对定量方法主要有两种，双标准曲线法和Delta-delta Ct法。 三、荧光定量PCR技术的应用 2、相对定量分析及实验方案---双标准曲线法 所谓的双标准曲线法就是对内参基因和所研究的目的基因都做绝对定量，然后将各生理阶段的目的基因的量和内参基因的量相除，得出一个比值；最后再将不同生理阶段所得的比值相除，最终得出目的基因在不同生理阶段的表达变化。 双标准曲线法思路直观、条理清晰，最大限度的避免了实验的误差，是一种很好的分析方法。 三、荧光定量PCR技术的应用 2．Delta-delta Ct法 此法是经定量的数学原理推导而来 该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默认两个基因扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用此法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。 三、荧光定量PCR技术的应用 3、SNP检测分析 基因组DNA是生物体各种生理、病理性状的物质基础。人类众多个体的基因组序列的一致性高达99%以上，但个体之间各种性状的差异仍然很大，包括对疾病的易感性、对同一疾病治疗药物的反应性等。在同一生物种群中明显存在两种以上不同的遗传性状，而且出现频率较高，称为遗传的多态性(polymorphism)，而遗传物质DNA的多态性如RFLP、STR、ABO血型、HLA和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是个体间差异的遗传学基础。 SNPs是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换(C与T互换，在其互补链上则为G与A互换)或颠换(C与A，G与T，C与G，A与T互换)等变异所引起的DNA序列多态性。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～100