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重组DNA技术与基因工程的基本概念 A 重组DNA技术的基本定义 B 基因工程的基本定义 C 重组DNA技术与基因工程的基本用途 D 基因工程的基本形式 D 基因工程的基本形式 A 重组DNA技术的理论基础 B 基因的分子生物学 C 基因工程的基本原理 D 基因工程的支撑技术 D 基因工程的支撑技术 A 用于核酸操作的工具酶 B 用于基因克隆的载体 C 用于基因转移的受体菌或细胞 重组DNA技术与基因工程的基本概念 A DNA的体外重组（切与接） B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增） C 转化子的筛选和鉴定（检） C 转化子的筛选和鉴定（检） 重组DNA技术与基因工程的基本概念 A 鸟枪法 B cDNA法 C PCR法 D 化学合成法 E 基因文库的构建 鸟枪法操作的改进 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 鸟枪法操作的改进 例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接 在连接前将DNA片段进行分级分离 2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb 鸟枪法操作的改进 冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法 凝胶DNA片段回收技术 鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构 5 目的基因的克隆与基因文库的构建 cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA法分离目的基因的基本程序 cDNA法法克隆目的基因的局限性 cDNA法克隆目的基因的基本战略 mDNA cDNA第一链的合成 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ cDNA第一链 引物 退火 逆转录酶 dNTPs cDNA第二链的合成 煮沸 NaOH 自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失 AAAAAAAAAAAAAA 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTT OH 3’ Klenow dNTPs S1 cDNA第二链的合成 DNApol dNTPs RNaesH 置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ 5’ S1 AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’ 3’ T4-DNA ligase cDNA第二链的合成 dCTP TdT 引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列 5‘ppp’5 G G AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ 3‘ HO 5‘ppp’5 G G AAAAACCCCCCCOH 3’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG AAAAAOH 3’ NaOH 退火 Klenow dNTPs cDNA法克隆目的基因的基本战略 双链cDNA的克隆 双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组 分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 cDNA法分离目的基因的基本程序 完备分离程序 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适