基因工程原理和技术12.pptVIP

* 第十二章 基因操作新技术 第一节 基因芯片技术与应用 一、定义 基因芯片(gene chip)是指固体支持物(硅片或玻璃片)上大量DNA片段或寡核苷酸的微阵列(microarray、微矩阵)。 基因芯片的特点：高通量、微型化、自动化。 基因芯片技术是指通过基因芯片与荧光分子标记核酸样品进行杂交进而获取样品中靶分子的数量和序列信息的技术。 二、基因芯片的类型 1、按载体材料分 玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。 载体材料必须满足的要求： ①载体表面必须具有可以进行化学反应的活性基团，以便与生物分子进行偶联。 ②使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量。 ③载体应当是惰性的和有足够的稳定性(机械的、物理的和化学的稳定性)。 惰性：是指载体的其他性能或特异性吸附都不应该干扰生物分子的功能。 稳定性：是指在进行分子杂交或结合时，可能遭受一定的压力或酸、碱条件而不发生变化。 玻片的优点：取材容易、荧光背景低、应用方便。 2、按点样方式分 原位合成芯片、微矩阵芯片、电定位芯片。 原位合成芯片：它将半导体中的光蚀刻技术运用到DNA合成化学中，以单核苷酸或其他生物大分子为底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，从而制备成芯片。 微矩阵芯片：将DNA或寡核苷酸片段用针点或喷点方法直接排列到玻片等载体，从而制备成芯片。特点是密度高、制作方便。 电定位芯片：是利用静电吸附的原理将DNA快速定位在硅基质、导电玻璃上，从而制备成芯片。特点是在电力推动下可使点样快速进行，但制作工艺复杂，点样密度低。 2202芯片针式点样仪 3、按DNA种类分 寡核苷酸芯片、cDNA芯片。 4、按用途分 表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片、指纹图谱芯片、测序芯片、毒理芯片。 5、三维芯片 先制备聚丙烯酰胺凝胶块阵列，然后再将寡核苷酸固定在凝胶块中。 6、PNA芯片 PNA是一种N-(2-氨乙基)-甘氨酸为骨架的核酸衍生物。 提高杂交温度，解决dsDNA及ssDNA的二级结构对杂交的影响。 三、基因芯片的实验操作 1、基因芯片的制作 异种DNA平行实验对照、封闭对照(阴性对照)、归整化对照(Actin、GAPDH) 2、样品探针的制备 ①RNA提取 ②RNA样品的质量检测 ③标记 逆转录标记cDNA 荧光素标记的核苷酸：Cy3-dUTP、Cy5-dUTP 3、杂交 4、信号检测 芯片扫描仪 5、结果分析 相关软件 四、基因芯片的应用 1、基因表达分析及功能研究 2、基因测序 3、医学 疾病的诊断、药物筛选、指导用药、药物的毒理研究 4、环境保护 一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害；另一方面通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。 5、农业 一方面是筛选农作物的基因突变，并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因；另一方面是利用基因芯片技术筛选、开发高效低毒的生物农药 6、军事和司法 生物战病原体检测、研制生物战保护剂。 犯罪疑犯的DNA指纹图谱鉴定、亲子鉴定 五、基因芯片使用应注意的问题 1、基因芯片类型的选择 2、基因芯片数量 3、样品量 4、结果分析 荧光强度在0.5~2.0之间是无差异的。 不能单凭基因芯片的检测结果对基因间相互作用关系下结论。 5、多种生物芯片结合应用 生物芯片 基因芯片 细胞芯片 蛋白质芯片 组织芯片 第二节 差异克隆技术 差异克隆技术是指用于克隆一种材料中表达而其他材料中不表达的未知序列基因的技术。 差异克隆技术 基于cDNA文库的差异克隆 基于PCR的差异克隆 差异显示筛选 减法杂交克隆 差异显示PCR 减法杂交PCR 一、差异显示筛选 基因芯片技术的应用 *