猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株构建论文.doc

目 录 摘 要 III 关键词 III Abstract III Key words III 英文缩略词表 IV 1前言 1 1.1口蹄疫的基本特征 1 1.1.1口蹄疫病毒基本概念 1 1.1.2口蹄疫病毒生物学特征 1 1.1.3口蹄疫病毒危害 1 1.2泛素蛋白及其对抗原的影响 2 1.3 siRNA干扰机制 3 1.4 γ干扰素与口蹄疫免疫 4 1.5 FMD疫苗研究进展 5 1.6本实验研究的目的与意义 6 2实验材料 6 2.1菌种、毒株、载体与质粒 6 2.2主要药品与试剂 6 2.3主要培养基及配制 7 2.4缓冲液及其配制 7 2.5其他溶液 7 2.5空斑筛选与纯化相关试剂 8 2.6寡核苷酸引物 8 3实验方法 8 3.1转移载体PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建策略 8 3.1.1限制性内切酶酶切反应 9 3.1.2酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测 9 3.1.3酶切产物的回收 9 3.1.4回收产物的去磷酸化反应 9 3.1.5目的基因与载体的酶连反应 9 3.2 感受态细胞的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化 10 3.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法） 10 3.2.2质粒的转化 10 3.2.3质粒的小量制备（OMEGA试剂盒） 10 3.2.4质粒的大量制备（OMEGA试剂盒） 11 3.2.5阳性质粒的酶切鉴定 11 3.3以PRV为载体表达FMDV抗原蛋白基因P1，泛素蛋白与抗原P1的融合基因Ubi- P1，RNA干扰基因shRNA，干扰素基因IFN-γ的重组病毒的构建 12 3.3.1细胞的培养、冻存与复苏 12 3.3.2 PRV TK-/gE-/LacZ+基因组DNA的提取 12 3.3.3脂质体介导的共转染 13 3.3.4重组病毒空斑纯化和PCR鉴定 13 3.3.5鉴定用PCR模板处理 14 3.3.6重组病毒PCR鉴定 14 4结果与分析 15 4.1转移质粒PIECMVUbiP1的构建 15 4.2转移质粒PIECMVUbiP1P1的构建 15 4.3转移质粒PIECMVUbiP1P1SiFIFNγ的构建 16 4.4共转染产物接毒第三代PCR鉴定 17 4.5重组病毒的空斑纯化及PCR鉴定 18 4.5.1空斑的形成 18 4.5.2在PK-15细胞上的第一轮空斑筛选 19 4.5.3在Vero细胞上的第一轮空斑筛选 20 4.5.4 重组病毒的空斑筛选结果 20 5讨论 20 5.1 载体的构建 20 5.2 细胞的传代培养 21 5.3 空斑筛选实验 21 5.3.1 空斑筛选细胞的选择 21 5.3.2 RNA干扰对空斑筛选结果的影响 22 5.3.3干扰素γ对空斑筛选结果的影响 22 参考文献： 22 致 谢 24 猪O型口蹄疫新型基因工程疫苗毒株的构建 The construction of recombinat Virus for Generating a Novel Genetic Engineering Vaccine Agansit O Type FMDV of Pig 摘 要 口蹄疫是一种急性、高度传染性的病毒性传染病，虽自20世纪初口蹄疫疫苗已经在世界部分地区应用，但目前全球口蹄疫疫情依然严重，也构成了世界动物及动物产品贸易的障碍。由本实验室构建的猪伪狂犬病毒基因缺失株PRV TK-/gE-/LacZ+作为一种病毒载体，具有安全性好、容量大、重组效率高等优点，本研究用人工合成的O型口蹄疫P1基因作为抗原基因，用和泛素（Ub）融合的UbiP1作为另一个抗原基因同时达到增强细胞免疫效果，再将针对口蹄疫3B基因设计的shRNA和具有抗病毒及免疫调节效果的猪IFN-γ与以上两个功能基因串联，构建了具有四个功能基因的转移载体，将此转移载体和PRV缺失株TK-/gE-/LacZ+共转染细胞，发生基因重组后进行了空斑纯化，经鉴定，初步得到了含有P1基因、UbiP1、shRNA、IFN-γ四个功能基因的重组伪狂犬病毒，为进一步构建新型基因工程疫苗打下基础。 关键词：抗原基因；泛素蛋白基因；干扰素基因；重组病毒 Abstract Foot and mouth disease (FMD) is an acute, highly contagious virul infection disease. Although vaccines, available since the early 1900s, have been used in parts of the world, the disease still is a serious globe outbtreak and become sanitary barrier to the commerce o