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第二节 基因工程四大要素 四大要素解决5大操作元件的几个问题 1、用什么来”切“？”切“什么？ 2、用什么来”接“？”接“什么？ 3、”转“入哪里？ 4、怎样“增”？ 5、怎样“检” ？ 一、工具酶 （一）限制性内切核酸酶 P21 1、概念 由1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统 由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 1、用酶源生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，斜体书写。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 2、用一个大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示分离到的第几个，正体书写。如EcoR I，EcoR V。 同裂酶：P22 来源不同， 识别序列相同， 酶切位点相同或不同。 同尾酶：P22 内切酶切割的位点不同，但具有相同的黏性末端，这一组酶成为同尾酶。 平末端： 4、应用 （1）限制酶切割位点提供了DNA物理图谱的特异性标记 （2）酶切产生的特异性片段可用分子克隆的手段加以纯化 （3）酶切产生的片段为各种各样的其他DNA酶学操作提供了基本底物。 5、DNA末端长度对限制酶切割的影响 两种DNA连接酶 （1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端 （2）T4噬菌体的连接酶：连接粘性末端、齐平末端 功用：DNA重组中促使载体与DNA连接 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割（“分子剪刀”或“分子手术刀”“基因刀”之称 ） 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 （三）其它工具酶： 1、甲基化酶：---来自细菌防御系统 甲基化对限制酶切的影响 （1）、修饰酶切位点----使本可被酶切的不受酶切 （2)、产生新的酶切位点－－－使本不能被酶切的能被酶切 (3)、对基因组作图的影响 2、DNA聚合酶(DNA polymerase)—来自DNA复制系统 催化DNA的合成活性（主要活性）：把dNTPs连续地加到引物的’ 3’—OH端，催化核苷酸的聚合作用。（聚合酶的共同特点） 其他活性（相辅助的活性） 3、耐热DNA聚合酶 来源：噬高温的细菌。 基本特性：在高温下具有活性（90-100℃） 用途：主要用于PCR 4、反转录酶（reverse transcriptase） 依赖于RNA的DNA聚合酶（以RNA为模板） 基本特性：5’ →3’合成DNA活性，但无3’ →5’外切酶活性 主要用途：cDNA克隆中合成第一条链/提取RNA反转录成DNA，再PCR（因为内含子的存在） 5、末端转移酶 来源：小牛胸腺 基本特性：不依赖于模板的DNA聚合酶。 应用：P26—平末端→粘性末端 6、核酸外切酶exonuclease （与核酸内切酶相对应 ） 一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。（作用于DNA或RNA） 单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶 基因工程应用： P26—粘性末端→平末端 7、碱性磷酸酯酶： alkaline phosphatase 最适pH在7.0以上，催化各种磷酸单酯键水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖的酶，也可以催化磷酸基团的转移反应，但不能水解磷酸二酯键。 应用：P26 8、RNA酶RNase： RNase的特点： 抗酸抗碱,具很广pH作用范围 抗高温严寒(0~65℃均具活性，100℃也不能使之完全失活） 抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性） 酶活性不需要辅助因子 存在范围广 总之 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸外切酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 RNA酶---分解RNA 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 1、载体：将外源DNA或基因携带入适当宿主细胞（host cell）的工具。 2、载体的种类 克隆载体：携带重组DNA进入在宿主细胞内进行大量复制 形成大量的基因克隆。 被克隆的基因不一定会表达 但一定被大量复制 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。 人工染色体载体P33：大DNA片段克隆载体 表达载体：使目的基因表达，生产出我们需要的产物。 2、载体具备的条件 (掌握质粒载体，