临床检验免疫学 生物素亲和素免疫放大技术课件.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * 它是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。 * 它如同酶免疫测定中的底物， 配入缓冲液中， 是ECLI反应中的电子供体。 * * * 发光剂 [Ru(bpy)3]2+和电子供体TPA在阳极表面可同时各失去一个电子而发生氧化反应，使二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂；另一方面，TPA 被氧化成阳离子自由基TPA+●，后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基TPA●，这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的[Ru(bpy)3]3+，使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激发态的[Ru(bpy)3]2+通过荧光机制衰减，发射出一个波长620nm的光子，重新生成基态的[Ru(bpy)3]2+。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系,故可测出待测抗原的含量。发光标记物不被消耗，可以循环发光，这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号得以增强。 * 酶免技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光免疫技术（FIA）、时间分辨荧光免疫技术（TRFIA） 一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程,其中应用了“亲和素-生物素”放大系统，使检测的灵敏度大大提高 * 用抗原或抗体包被磁颗粒,与标本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过一定模式的免疫学反应后,最终通过磁场将结合酶标记物IC和游离酶标记物进行分离的技术。 * 结合了活化的三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)3]2+ + N羟基琥珀酰胺酯（NHS）的TSH抗体和结合了生物素的TSH抗体与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9分钟。三联吡啶钌标记抗体和生物素标记抗体与待测标本 同时加入一个反应杯中孵育反应 * 将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。将链霉亲和素（SA）包被磁珠加入反应杯中，再次孵育，使生物素（B）通过与亲和素（A）的结合，将磁珠、Ab连接为一体，形成双Ab夹心法。 链霉亲和素包被、生物素化抗体、以增大抗体结合量，达到放大效果。  * 双抗体夹心法 * 蠕动泵将形成的 [Ru(bpy)3]2+－抗体－抗原－抗体－磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的TSH抗体（与生物素结合的和与[Ru(bpy)3]2+结合的抗体）也被吸出测量室。蠕动泵将形成的 [Ru(bpy)3]2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的Ab也被吸出测量室。 * 蠕动泵加入TPA，电极加电压，启动ECL反应过程。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，其与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系,故可测出待测Ag的含量。紧接着，蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。 * 终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。 * * 链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）一分子SA可与4分子B相结合。在ELECSYS的试剂中，SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上，形成通用的能与B结合的固相载体。另一试剂为与经活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时，抗原或抗体即包被在磁性微粒上。 * * * 甲状腺激素，甲肝，乙肝，已成为一种重要的非同位素标记免疫分析方法，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测。 * 试剂不开放、检测成本高, 成为电化学发光技术应用的最大障碍 * 小 结 BAS既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性 检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于各类反应 体系中反应物的分离、纯化。 BAS在实际应用中如酶免疫测定、荧光免疫技术、 放射免疫测定及分子生物学中所具有的巨大优越性主要 表现在以下几个方面：灵敏度高、特异性强、稳定性 高、适用性广、无放射性污染。 谢 谢 酶联免疫斑点试验—— ELISPOT enzyme linked immunospot , ELISPOT 历史回顾 1971年荷兰学者van Weeman 和瑞典学者Engvall最先建立嗨联免疫吸附试验 (ELISA)，递经完善和拓展，迄今已成为免疫测定中应用最广泛的一项技