医学研究荧光定量原理与分析方法张玖强课件.pptVIP

* * * * * 谢谢！ * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * rRNA丰度高，占总RNA的80%，研究表达丰度较高的基因时比较适合；rRNA转录调节受其它因素影响，如28s和18s rRNA在有细分裂期间表达量明显减少或停止表达，所以在研究与细胞周期相关的基因时就不适合以此为内参；另外，由于表达量较高，在研究丰度相对较低的基因时，有时就不太适用，比如Multiplex。当然也有rRNA的忠实拥护者，有人认为表达量高才时定量准确的关键，总之各有说法，但选择看家基因最关键的地方还是看该基因在你所研究的体系下是否稳定表达，可通过选择两个看家基因在不同的处理间相互比较，看两者比值是否恒定，如果一致，那么他们都可用作这个实验的看家基因。 * * * * * * 内容概要 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的分类 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 SYBR法实验流程及注意事项 Sample 25 绝对定量分析方法简介－－绝对定量定义 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 未知样品与已知浓度的标准曲线进行比较 标准品的一些标准： 必需用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同 标准品必需是经过准确定量的（例如，用分光光度计定量） 标准品必需是标准化的（例如，同一化的细胞数） 在每组实验时，必需用相同的阈值设定来确定Ct值 绝对定量分析方法简介－－绝对定量的标准品 绝对定量分析方法简介－－标准样品的制备 拷贝数的计算 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014 倍比梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v 绝对定量分析方法简介 乙肝病人血液中HBV的绝对定量 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 试剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe） 目录号（FP203） 设置对照：浓度为106、105 、104 、 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照 实验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数 绝对定量分析方法简介－－举例1 绝对定量举例：HBV病毒检测 以Taqman探针进行 Sample: HBV阳性标准品，分别含有5×103、5×104、5×105、5×106 copies /ml copies/ml Ct1 Ct2 Mean Ct STD 5×103 28.18 28.64 28.41 0.16 5×104 25.25 25.14 25.19 0.04 5×105 22.11 22.46 22.28 0.12 5×106 18.63 18.92 18.77 0.10 BLANK None None 实验数据： 绝对定量分析方法简介－－举例2 扩增效率（E）计算 E=10-1/斜率 =10-1/-3.17 =2.03 E%=(2.03-1) ×100% =103% 标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线 y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988 绝对定量分析方法简介－－举例2 如未知样本Ct为20.5 标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线 将Ct值带入线性方程： 20.5= -3.1726 X + 37.52 X= 20.5-37.517 -3.1726 =5.36 QuantityUnknown=105.36 =229087 copies y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988 绝对定量分析方法简介－－举例2 内容概