核因子b在中耳胆脂瘤发病机制中的作用研究课件.pptVIP

胆脂瘤组织中NF-κB活化与IL-6基因异常表达 武汉大学人民医院 耳鼻咽喉－头颈外科 许 昱 陶泽璋 前 言 中耳胆脂瘤的发生、发展是一个复杂的病理生理过程，其确切机理至今仍不清楚。但基本达成共识的是胆脂瘤的形成与机体为防御慢性炎症而产生的一系列异常免疫应答有关。免疫反应的异常是造成胆脂瘤持续发展和骨质破坏的内在重要因素，而多种细胞因子又在介导在这一异常的免疫反应中起重要作用 目前已发现多种细胞因子在胆脂瘤中存在异常表达，但这些细胞因子释放和调控的机制不清楚 许多与炎症反应密切相关的细胞因子的基因启动子和增强子部位均存在NF-κB的结合位点，即这些细胞因子的激活和转录均受到NF-κB的调控 选择IL－6作为细胞因子代表 采用RT-PCR技术及凝胶电泳迁移阻滞法（EMSA）研究胆脂瘤组织中NF-κB活化 与细胞因子IL-6表达的关系 材料和方法 取材： 标本：中耳胆脂瘤组织标本10例 正常外耳道皮肤组织6例 取材方法：取自中耳乳突手术术中，标本取出后清洗片刻，在显微镜下仔细剔除胆脂瘤鳞屑及其它坏死组织，立即置－80℃冰箱 设两组对照以鉴定NF-?B探针的特异性 特异性竞争抑制实验: 反应体系中加入 50倍（即1μL）未标记的特异性NF-?B探针 非特异性竞争抑制实验：反应体系中加入50倍（即1μL）未标记的非特异性AP-2探针 用法国VL自动凝胶成像及分析系统进行照相和分析 结 果 图2－1：EMSA显示胆脂瘤组织的滞后条带强度及面积明显高于正常皮肤组织（1：未加核蛋白的阴性对照，2、3、4：正常外耳道皮肤组织；5、6、7、8、9：中耳胆脂瘤组织） 讨 论 IL-6 是重要的具有广泛免疫调节作用的细胞因子，生物活性多样： 诱导破骨细胞的形成和活化 调节细胞的增殖和分化 促进B细胞增殖分化和分泌抗体 促进T细胞增殖分化和表达IL-2受体 促进巨嗜细胞成熟 Bujia：免疫组化研究，酶联免疫吸附实验 Marendat ：免疫组化研究胆脂瘤上皮内IL-6 的表达与听小骨链的破坏的关系 本研究：RT-PCR技术 在RNA水平证明IL-6在胆脂瘤组织中存在异常转录和过度活化，进一步证实IL-6可能参与了胆脂瘤的发生发展的病理过程 尽管细胞因子在胆脂瘤发病中的作用已得到公认，但究竟是什么机制在调控众多细胞因子的释放尚不清楚 炎性介质的基因表达是通过转录机制来实现的，由于在IL-6等细胞因子的转录启动子上均存在NF-κB的结合位点，因此NF-κB的活化在胆脂瘤细胞因子产生中应起着关键调控作用 本实验采用EMSA技术检测NF-κB在核内的DNA结合活性以研究NF-κB在胆脂瘤组织中的活化状态，结果证实胆脂瘤组织存在NF-κB 的过度活化 研究亦显示：IL-6mRNA的表达水平与NF-κB的活化呈显著正相关 ——NF-κB很可能在胆脂瘤的发生和持续发展中起重要作用，例如在胆脂瘤细胞因子的调控中起着扳机点的作用 由于NF-кB 可以被炎性细胞因子激活，因此释放的细胞因子反过来又可进一步活化NF-κB，由此形成一个正反馈调节，使NF-кB 处于一个持续的活化状态，导致细胞因子等炎性介质大量释放，形成炎症的级联反应，并使炎症不断扩大，导致胆脂瘤的持续发展及广泛的骨质破坏，而NF-κB在其中可能起关键作用 目前，靶向NF-κB的治疗已在很多疾病中取得了重大的进展。如果我们能抑制NF-κB的活化，就有可能阻断IL-6 及其它炎性相关因子的转录途径，从而打断炎性因子对胆脂瘤的后续继发损伤，控制胆脂瘤的异常增殖 这对胆脂瘤的防治将具有重要意义，将是我们在以后的研究中重点要探索的问题。本课题为后续的研究提供了重要的理论依据，同时本课题的体外研究部分也为将来靶向NF-κB的治疗提供了重要的实验基础 * * 胆脂瘤组织中NF-κB活化与细胞因子表达的关系？ 临床资料 NF－κB核蛋白DNA结合活性检测 采用凝胶电泳迁移阻滞法（EMSA） IL－6mRNA表达的半定量检测 采用逆转录－PCR法 检测指标及技术路线 凝胶迁移率竞争抑制实验 ＝ 目的基因相对表达量 目的基因条带密度 GAPDH 基因条带密度