规模化禽禽病实验室诊断.docxVIP

第五章 病毒的分离培养病毒病是威胁现代化养禽生产的重要疾病之一。要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：①从病禽体内分离出病毒；②在实验动物或寄主细胞中可以培养；③证明这种培养物具有滤过性；④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；⑤能重新分离出病毒。由此可见病毒分离是将可能含有病毒的标本接种细胞、鸡胚或实验动物，并从其中检出病毒的一种方法。因此，病毒分离和（或）鉴定是诊断病毒感染的“金标准”。虽然并不是所有的病毒性疾病都需要根据病毒分离来进行诊断，但是当新疾病流行、血清学检测产生交叉反应、2种病毒无法区别，需进一步确诊，同一症状的疾病可能由多种病毒引起时，则需要分离病毒。病毒的分离与鉴定对监测流行病的新动向、研究新疾病、新病毒以及新病毒与疾病的关系都有重要的作用。第一节 病毒的分离成功分离病毒的关键在于正确采集和处理标本，不同病毒所需的标本也不同（见表），一、病料的采取病毒性传染病一般在发病初期和急性阶段比较容易分离出病毒。因此，采取病料的时机必须适当。常用病毒分离的病料有血液、粪便、渗出液、脑脊液、水疱液、活检组织或尸检组织等。根据病毒的性质采取不同病料。表 常见禽类病毒分离可采集的标本病毒种类标 本疱疹病毒血液、疱液、拭子、脑或肝等流感病毒鼻、咽分泌物新城疫病毒鼻、咽分泌物禽腺病毒分泌物、粪便、组织标本传染性法氏囊病毒法氏囊、脾脏、胸腺禽白血病病毒肿瘤组织、感染鸡鸡蛋卵清、体液网状内皮组织增殖病毒口腔和泄殖腔拭子、病变组织、血液淋巴细胞鸡传染性贫血病毒肝脏禽痘痘痂、伪膜传染性支气管炎病毒喉头分泌物鸭瘟口腔分泌物、粪便、肝、脾、脑鸭病毒性肝炎肝脏小鹅瘟病毒肝、脾、肾、脑等雏番鸭细胞病毒肝、脾、胰腺等二、标本的保持由于病毒对热不稳定，收集的标本通常应放在冷的环境及加用保护剂（如Hank’s液、牛血清白蛋白等）以防病毒失活。无菌操作是非常重要的，盛放标本的容器及保护剂应当是灭菌的，防止其他微生物污染。标本的运送一般在4℃左右条件下进行。实验室受到标本后应立即处理，反复冻融标本会降低病毒的分离率。如果标本在24h以内接种，一般保存在4℃；如果需要延搁较长时间，应预留部分标本，以备再次接种或进一步检查用。三、安全问题病毒诊断实验室的安全问题也是非常重要的。级别不同的实验室只能进行同类病原的检查。注意安全的目的主要有2点，一是避免工作人员实验室感染，另一是防止病毒从实验室扩散。最安全的办法是实验室工作人员头脑里必须保持这样一个概念，即认为任何标本都具有传染性而养成良好的工作习惯。溢出物要用次氯酸钠、过乙酸或戊二醛消毒；禁止口吸操作；必须穿上工作服，必要时应该加戴手套。第二节 病毒的培养采取可能含有病毒的材料，接种动物、鸡胚或组织培养。被接种的动物、鸡胚或细胞出现死亡或病变时（有的病毒须盲传数代后才能检出），可应用血清学试验进一步鉴定。供接种或培养的病料应作除菌处理。除菌方法有滤器、高速离心除菌和用抗生素处理三种。标本接种于哪一种动物、鸡胚或细胞，以及选择哪一种途径，主要决定于病毒的嗜性。一般神经嗜性病毒主要是动物脑内接种；嗜呼吸道病毒接种动物鼻腔及鸡胚羊膜腔；嗜皮肤性病毒接种动物皮内、皮下或鸡胚绒毛尿囊膜；嗜内脏病毒可接种于禽的腹腔、静脉、肌肉。但是，近几年，由于组织培养技术的广泛开展，多数病毒都能用组织培养进行分离鉴定。一、细胞培养病毒可能含有病毒的标本应尽快地接种到合适的宿主细胞是成功分离病毒的关键。基于病毒必须在活细胞内增殖这一原理，选择合适的细胞进行病毒分离可对疾病做出诊断。细胞的选择与病毒的种类有关，病毒对细胞的选择是特异性的，不是任何病毒都可在任何细胞内生长繁殖。通常，原代细胞（如鸡胚细胞）有广谱的病毒适应性，因为它含有各种不同类型的细胞。为了获得较高的病毒分离率，一般每份标本应接种一株原代细胞、一株二倍体细胞和一株肿瘤细胞。此外，每份标本至少应接种3管以上的细胞，以增加实验的可靠性。无论接种标本与否，培养细胞一般应放在合适的温度和pH条件下（37℃，Ph7.4）下生长。细胞培养分离病毒的简易流程见图：标本收集标本处理标本接种细胞37℃吸附1~2h弃去接种标本加适量维持液培养，24~72h换液一次每天观察CPE存在与否或其他指标鉴定病毒收获病毒二、鸡胚接种培养病毒（一）病料的采取及处理 采集病料，将材料制成1︰5~1︰10的乳剂，并且每毫升加入青霉素和链霉素各1000IU，以抑制可能污染的细菌内，后置冰箱中作用2~4小时，然后离心沉淀，取其上清液作为接种材料。在这同时，应对接种材料作无菌检查。取接种材料少许接种于肉汤、血琼脂斜面及厌氧肝汤各一管，置37℃培养观察2~6天，应无菌生长。如有细菌生长，应将原始材料再作除菌处理，也可改用细菌滤器过滤除菌，但过滤后的滤液含病毒量也会减少，应引起注意，因此，如有