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绿色荧光蛋白在贵阳腐霉组成性表达 　　摘要：以潮霉素抗性基因ｈｐｈ为筛选标记，以双元载体ｐＰＫ２为基本骨架，将增强型绿色荧光蛋白基因ｅｇｆｐ置于组成型启动子ＰｇｐｄＡ和色氨酸Ｃ终止子ＴｔｒｐＣ之间，构建了组成性表达ｅｇｆｐ的载体ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ，利用根癌农杆菌介导的遗传转化法，转入贵阳腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍ　ｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）表达。对转化子进行ＲＴ－ＰＣＲ和荧光显微镜检测，结果表明，ｅｇｆｐ基因在贵阳腐霉转化子中能稳定表达。 　　关键词：贵阳腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍ　ｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）；基因转化；绿色荧光蛋白；根癌农杆菌 　　中图分类号：Ｑ７８６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5801-03 　　贵阳腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍ　ｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）是贵阳医学院苏晓庆教授于１９９４年分离得到的一株灭蚊真菌［１］。经研究证实它具有灭蚊能力较强、繁殖速度快、易于人工培养［２］和可移植性强以及对非靶生物相对安全等诸多优点［３，４］。由于昆虫病原真菌广泛存在于自然界，真菌制剂一旦释放到自然环境中，需要准确鉴别染病昆虫是否为人工释放的菌株制剂所致，而在真菌制剂中引入安全、可靠的遗传标记则为其提供了可能。增强型绿色荧光蛋白（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）是一种优化的突变型绿色荧光蛋白，其荧光比野生型强３５倍，具有结构稳定、高效表达、无种系依赖性等特点，通过与目标基因融合，可进行真菌的细胞基因表达和蛋白定位检测及细胞示踪标记、突变体致病力检测、生态学行为以及与其他生物互作等研究，因此是目前标记研究真菌的重要手段之一。此次研究以贵阳腐霉菌丝体为受体材料，利用根癌农杆菌介导的遗传转化技术将含ｅｇｆｐ的表达载体转入贵阳腐霉，以获得带有ＥＧＦＰ标记的贵阳腐霉菌株，为研究其对蚊幼虫的入侵过程以及两者之间的互作模式打下基础。 　　１ 材料与方法 　　１．１ 材料 　　１．１．３ 引物 试验所用引物序列见表１。 　　１．２ 方法 　　１．２．１ ｅｇｆ??组成性表达载体ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的构建 用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ酶切质粒ｐＳＫ－ｈｐｈ，回收ＴｔｒｐＣ片段（７７０　ｂｐ），与用相同酶切的质粒ｐＵＣ１８连接转化，重组载体命名为ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ。以质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１为模板，pＥＧＦＰ１和pＥＧＦＰ２为引物，ＰＣＲ扩增ｅｇｆｐ基因片段，用ＢａｍＨ　Ⅰ和 ＢｇｌⅡ双酶切后纯化回收，与同样双酶切的ｐＵＣ1８－ＴｔｒｐＣ连接，转化验证，命名为ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ－ＥＧＦＰ。以质粒ｐＡＮ７－１为模板，用引物ＰｇｐｄＡ１和ＰｇｐｄＡ２　ＰＣＲ扩增ＰｇｐｄＡ基因片段，用ＫｐｎⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切后纯化，回收该目的片段，与经过相同双酶切的载体ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ－ＥＧＦＰ连接，命名为ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ－ＥＧＦＰ－ＰｇｐｄＡ，提取其质粒，用ＨｉｎｄⅢ酶切后电泳，凝胶回收３．６　ｋｂ的大片段ＰｇｐｄＡ－ＥＧＦＰ－ＴｔｒｐＣ，与相同酶切的质粒ｐＰＫ２连接，筛选阳性转化子，用ＢａｍＨ　Ⅰ单酶切验证，得到正向连接的转化子为质粒ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ。 　　１．２．２ ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４转化 采用冻融法［５］。 　　１．２．３ 根癌农杆菌介导的ｅｇｆｐ基因在贵阳腐霉的遗传转化 按龙朝钦等［６］的方法稍改动。取含质粒ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的ＬＢＡ４４０４过夜培养物，用含２００　μｍｏl／Ｌ　ＡＳ的ＹＥＰ液体培养基于２８　℃振荡培养６　ｈ后，与贵阳腐霉菌丝混合，于２６　℃培养１　ｄ。弃上清，加入５００　μＬ　ＩＭ液体培养基（含２００　μｍｏl／Ｌ　ＡＳ），于２６　℃培养２　ｄ。悬浮沉淀，将该混合物涂布到ＫＰＹＧ２平板上（含２００　ｍｇ／Ｌ潮霉素Ｂ和２００　ｍｇ／Ｌ头孢霉素），于２６　℃培养直至抗性菌丝长出。 　　１．２．４ 转化子的ＲＴ－ＰＣＲ检测 贵阳腐霉及转化子总ＲＮＡ的提取采用ＴＲＩＺＯＬ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）提取。用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）　逆转录并去除基因组ＤＮＡ。以pＥＧＦＰ１和pＥＧＦＰ２为引物，利用ＰＣＲ对得到的抗性菌落进行分子验证，扩增ｅｇｆｐ基因片段。 　　１．２．６ 荧光的观察 临时制片，利用Ｏｌｙｍｐｕｓ荧光显微镜在波长４８０　ｎｍ下进行荧光观察、照相。 　　２ 结果与分析 　　２．１ ｅｇｆｐ组成性表达载体ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的构建与酶切验证结果 　　２．２ 组成性表达ｅｇｆｐ重组菌株的筛选与验证 　　２．３ 贵阳腐霉转化株ｅｇｆｐ的荧光检测 　　３ 讨论 　　绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）来源于海洋生物水