A549细培养方案——适用于各种细胞培养.docVIP

A549细胞的培养 A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以1：2～1：3传代培养都是可行的。 一、 [所需溶液] 细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)——无Ca、Mg NACL 8.00g； KCL 0.20g; KH2PO4 0.20g; Na2HPO4 .。12H2O 1.15g 加水至 1 000mL,将PH调至7.4，高压灭菌。 消化液 胰酶-PBS 结晶胰酶 2.5g; 高压灭菌后的PBS 1000ml 用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置—20℃保存。 胰酶—EDTA: 结晶胰酶 0.5g; EDTA盐溶液 0.2g 无Ca、Mg PBS 1 000ml 用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置—20℃保存。 细胞培养液：RPMI 1640培养液 配制方法： 将一袋干粉型RPMI 1640培养基溶于900ml三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。 加入丙酮酸钠 0.1g，NaHCO2 2g以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为 100U/ML 青霉素和100U/ML链霉素。(一般市售的青霉素为80 万 U/瓶，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml；市售的链霉素为100 万 U/瓶，将其溶解于5ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml)。 调整培养液的ＰＨ值，用ＰＨ精密试纸观察　ＰＨ７.２～７.４即可。 过滤法除菌，所使用的滤器为Ｏ２加压过滤，０.２２μｍ滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。 分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置—20℃保存。 二、［细胞的维持和培养］ 细胞的复苏 准备一个盛有３７℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有Ａ５４９细胞的冻存管，放于３７℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。 1000～２000 r，3～５min离心。 在无菌操作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。 用1ml枪头将上清液去除，加入1ml预热的细胞培养液将细胞吹散开，转移至25cm2培养瓶中。 补充4ml的RPMI 1640培养基，并且添加10%的胎牛血清。 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。 24h后，更换新的培养液。 常规传代培养。 A549细胞更换新的培养液 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。 用PBS反复冲洗细胞2～3遍。 加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。 各种液体需要量（ml） 表面积 25cm2 75cm2 150cm2 洗涤 3 5 10 胰酶 1～2 1～3 2～5 培养液 5 10 20 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。 A549细胞的传代 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。 向已经长满的细胞中加入消化液1ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面2～３遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。 加入1ml消化液，在37℃培养箱中孵育5～８min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。 加入5ml预热至37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。 吸取一半的细胞悬液，接种到新的25cm2培养瓶中，补足培养液，并且添加10%～20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为5～10ml。 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。 注意事项： 所有液体在加入细胞瓶前均应预热到37℃。所有液体均应调整PH至7.2左右，均不能超过7.4。 细胞消化传代时吹打不要产生气泡，吹打力量不宜过多，否则会损伤细胞。 严格执行无菌操作的要求。 尽可能减少消化液剩余量，过多时会对细胞产生损伤，可多添加些含牛血清的培养液中和。 培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。