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基础回归专项讲解之十九：基因工程 舟山中学 陈　钢 一、基因工程概念 1．概念：基因工程就是把一种生物的基因转入另一种生物体内，使其产生我们需要的基因产物，或者让它获得新的遗传性状的技术，其核心是构建重组DNA分子，因此人们也将基因工程称为重组DNA技术。 2．基因工程的特点：能够按照人们意愿，打破物种的界限，克服远缘杂交不亲和的障碍，定向地改造生物的性状，目的性强，一旦成功，便可遗传。 3．基因工程的理论基础 （1）基因拼接的理论基础：①DNA是生物的主要遗传物质；②DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。 （2）外源基因在受体细胞内表达的理论基础：①基因是控制生物性状的独立遗传单位；②遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流动方向；③生物界共用一套遗传密码。 二、基因工程的工具 1切割工具——限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶能够识别和切割DNA分子中一小段特殊的核苷酸序列，形成粘性末端或平末端（如下图），其作用位点是DNA分子骨架中的磷酸二酯键。 限制性核酸内切酶所识别的序列，都可以找到一条中轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，即有回文序列，如EcoRI的酶切（见右图）。 2缝合工具——DNA连接酶 DNA连接酶能将末端碱基互补的2个DNA片段连接起来，形成重组DNA分子，其作用位点也是磷酸二酯键。 常见的与DNA有关的酶有限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶和解旋酶，它们之间的区别如下表： 种类 限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用底物 DNA分子 DNA分子片段 脱氧核苷酸 DNA分子 作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对间的氢键 作用特点 切割目的基因及载体，能专一性识别DNA分子特定的核苷酸序列，并在特定位置切割 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上 将DNA两条链之间的氢键打开 作用结果 形成黏性末端或平末端 形成重组DNA分子 形成新的DNA分子 形成单链DNA分子 3载体工具——质粒 质粒主要来自于细菌，是位于细胞质中能自主复制的小型环状DNA分子。由于质粒具有对受体细胞无害、在受体细胞能自主复制、具有抗性基因等标记基因以及具有多个酶切位点等特点，所以它是基因工程常用的载体，用于把目的基因送入受体细胞，并在宿主细胞内使目的基因进行大量复制。 除质粒外，基因工程的载体还有噬菌体和某些动植物病毒，作为载体必需满足以下条件： （1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在载体本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 （2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 （3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组DNA的筛选。 （4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 （5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 要注意基因工程中工具与工具酶的区别。基因工程的工具是指限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体（主要是质粒），而基因工程中的工具酶仅指限制性核酸内切酶和DNA连接酶，不包含载体。 三、基因工程的基本操作步骤 1获得目的基因 （1）对于未知序列的目的基因，可以从基因文库获得 用多种限制酶将某种生物细胞的DNA切成不同片段，并把所有片段随机地分别连接到用同样限制酶切过的基因载体上，然后导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。需要时我们可以从基因文库中获得目的基因。 （2）对于已知序列的目的基因，可以采用人工合成的方法，常用的人工合成法有如下二种： 逆转录法 根据已知氨基酸序列推测并合成DNA （3）利用PCR技术扩增已获得的目的基因通过PCR技术对已获得的目的基因进行扩增，可以获得大量的目的基因。PCR的扩增反应过程包括以下几个主要过程。 第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。 第二步：将反应体系降温至55～60℃，使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。 第三步：将反应体系升温至70～75℃，在DNA聚合酶催化下，以游离的四种脱氧核苷酸为原料，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。 上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个