4种牙科金属材料对成纤维细胞L929凋亡相关基因及蛋白表达影响.docVIP

4种牙科金属材料对成纤维细胞L929凋亡相关基因及蛋白表达影响 　　[摘要] 目的 研究4种不同牙科金属材料（金合金、银钯合金、钴铬合金、镍铬合金）浸提液对小鼠成纤维细胞 　　L929凋亡相关基因及蛋白表达的影响。方法 以金合金（A组）、银钯合金（B组）、钴铬合金（C组）、镍铬合金（D组）的浸提液体外培养小鼠成纤维细胞L929，并以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基作为阴性对照（E组）。采用逆转 　　录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测了4种牙科金属材料浸提液对L929细胞凋亡相关基因caspase-3、8、9 mRNA和蛋白表达的影响。结果 4种牙科金属材料浸提液培养小鼠L929细胞48 h后，除A组与E组间差异无统计学意义外，各组间caspase-3 mRNA及caspase-9 mRNA表达差异有统计学意义（P 　　将对数生长期的L929细胞以浓度为每毫升6×104个接种于放有盖玻片的6孔板，24 h细胞贴壁后弃去原培养基，加入不同浸提液培养48 h。弃上清液，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3，95%乙醇室温固定10 min，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。取出细胞爬片，晾干，用中性树胶黏于载玻片上，PBS冲洗细胞爬片，3%过氧化氢室温静止10 min阻断内源性过氧化物酶的活性，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加入0.3%Triton-100，室温30 min，增加细胞的通透性，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加50 μL一抗（1∶200），阴性对照用PBS代替一抗，放置于湿盒中4 ℃过夜，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加50 μL的二抗，室温孵育40 min，0.1 mol·mL-1 PBS清洗5 min×3。加DAB溶液显色3 min。自来水冲洗，苏木素复染3 min，盐酸乙醇分化，自来水冲洗10 min，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察并拍摄照片。每张切片随机选取3个视野，caspase-3、8、9在细胞质中呈棕黄色染色为阳性表达，以细胞未着色或轻微着色为阴性。在高倍镜（×400）下拍摄照片， 　　应用Image Pro Pluss 6.0图像分析系统测平均光密度（optical density，OD）值，对各组切片的caspase-3、8、9表达强度进行半定量分析。 　　1.6 统计学分析 　　采用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理，数据以x±s表示，对caspase-3、8、9 mRNA及蛋白的表达进行单因素方差分析及最小显著差异（least signi-ficant difference，LSD-t）检验，P 　　0.05）。 　　2.2 免疫???化检测结果 　　各组OD值的检测结果见表4。由表4可见，cas-pase-3蛋白及caspase-9蛋白的表达差异显著（F值分别为195.05、745.83，P0.05）。B组和D组caspase-3和caspase-9呈阳性表达，各组caspase-8呈阴性表达（图2～4）。 　　3 讨论 　　牙科合金修复体长期处在唾液这一电解质环境中会发生不同程度的腐蚀，导致金属离子析出。如果这些离子超过一定的浓度，将对细胞造成损害。材料与机体短期或长期的接触而导致的细胞形态学变化是以往评价材料生物相容性的主要内容和方法。如果生物材料对机体的影响已经在整体水平和细胞水平上表现出来，那么在分子水平的基因表达方面势必已经造成影响，并且会极灵敏地反映出来。对于修复体材料析出的金属离子可能对口腔细胞和组织形成不良刺激的问题在医学界已基本达成共识，但直至2003年Faccioni等[9]和2004年Cortizo等[10]的研究报道揭示了修复体中析出金属离子对口腔黏膜细胞和成骨样细胞的DNA损伤和诱导凋亡作用，人们才开始在分子水平上探讨金属离子造成口腔组织不良刺激反应的作用机制。有研究[11-12]显示：金属离子 　　引起细胞死亡的方式主要是凋亡，有浓度依赖性和时间依赖性。caspases家族是细胞凋亡过程中的必需要素，caspase-3为caspase家族中的凋亡执行因子，被认为是细胞凋亡过程中的关键酶之一。正常情况下，胞质中caspase-3以单体、微量、无或低活性的前caspase-3形式存在，当细胞发生凋亡时，其变为有活性的caspase-3。caspase-8与caspase-9分别参与死亡受体通路诱导的凋亡和线粒体通路诱导的凋亡。以往研究[13]表明4种牙科合金的细胞毒性为0级，均显 　　示出良好的生物相容性。本研究在RT-PCR实验中发现4种牙科合金caspase-3 mRNA与caspase-9 mRNA表达