第十六节 血红蛋白的提取与分离(一).docVIP

　　 血红蛋白的提取和分离（一） 主讲：黄冈中学优秀生物教师　王小敏 ★课题目标 1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白； 2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。 ★课题重点 凝胶色谱法的原理和方法。 ★课题难点 样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 一、基础知识 （一）蛋白质提取和分离的原理 　　根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 （二）凝胶色谱法（分配色谱法） 1、概念：根据蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离的方法。 2、原理： 　　大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 　　小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 3、凝胶材料：微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。 4、分离过程： 　　洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 （三）缓冲溶液 1、作用：能够抵制外界的酸和碱对溶液pH值的影响，维持pH基本不变。 2、缓冲溶液的配制： 　　由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。 　　在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是pH=7.0的磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察红色和材料的科学研究活性。 （四）电泳 1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2、原理： 　　不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 　　影响蛋白质分子运动速度的因素 　 决定运动方向 电场作用力 形成阻力 决定运动速率 电荷性质 √ 　 　 　 电荷量 　 √ 　 √ 分子形状 　 　 √ √ 分子大小 　 　 √ √ 3、常用方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 　　聚丙烯酰胺凝胶电泳： 　　（1）在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。 　　聚丙烯酰胺凝胶：由单体丙烯酰胺和交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。 　　（2）原理： 　　蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少及分子的大小等因素。加入SDS可消除净电荷对迁移率的影响，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 　　（3）SDS作用机理： 　　SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 　　（4）用SDS测定蛋白质分子量的方法 　　使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。 　　电泳检测结果： （五）血红蛋白 　　在红细胞的组成中，约90%是血红蛋白。它由四个肽链组成，包括两个α—肽链和两个β—肽链。每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色。 ? - 返回 - 　　 同步测试 一、选择题 1、凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是（　） A．改变蛋白质分子通过凝胶时的路径 B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度 C．将酶或纽胞固定在凝胶中 D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度 2、利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（　） A．相对分子质量大的　　　　　　B．溶解度高的 C．相对分子量小的　　　　　　　D．所代电荷多的 3、缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（　）基本不变。 A．温度　　　　　　　　　　　　B．pH C．渗透压　　　　　　　　　　　D．氧气浓度 4、电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（　）的电极移动。 A．相同　　　　　　　　　　　　B．相反 C．相对　　　　　　　　　　　　D．相向 ? AABB -END- 　　 课外拓展 　　凝胶色谱的大量研究工作仍是多方面的，其中仪器、填料、联用技术、色谱理论等方面的进展是和整个液体色谱的进展相关的。但是下面四个研究动向意义较大，值得注意。凝胶色谱法分析仪器通过与其他仪器联用，解决凝胶色谱法测定高聚物