蛋白测定 实验设计.docVIP

烟草蛋白含量测定实验方案 原理：碱性条件下，蛋白(肽键)与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+..BCA与Cu+形成稳定的紫蓝色复合物。 BCA分子式： BCA蛋白质检测流程： 一：试验试剂 试剂A: 1% BCA二钠（2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠）；2% Na2CO3; 0.16%酒石酸钠；0.4% NaOH; 0.95% NaHCO3. PH=11.25. （4。C保存） 试剂B: 4%CuSO4.（4。C保存） BCA工作液：100ml试剂A+2ml试剂B.（现配现用，体积比为50：1—50：2 ，加大Cu2+可以加快反应速度） 蛋白标准液：1mg/mL BSA[用生理盐水(0.9%NaCl)溶解]。 （4。C保存） BCA二钠，牛血清白蛋白（BSA）（-20。C保存） 二：试验 2.1 标准曲线：（0-1mg/ml） 母液浓度（BSA 1mg/ml） 编号 1 2 3 4 5 6 蛋白浓度（mg/ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 取母液体积（ul） 0 20 40 60 80 100 补加生理盐水（ul） 100 80 60 40 20 0 BCA液（ml） 3 3 3 3 3 3 37℃水浴30min， 冷却 OD562 横坐标为吸光度值，纵坐标为蛋白量 2.2 样品测定 称量0.25g左右烟草，充分研磨,过滤（尽量不要破坏蛋白结构的肽键，不要引入使蛋白变性的因素), 用蒸馏水定容至50mL。 取100uL稀释液于试管，3ml BCA工作液,充分震荡30S; 停止震荡，在37。C水浴样品30min,冷却; 测定562nm的吸光度值； 通过标准曲线求出待测样品蛋白含量。 烟叶蛋白含量计算公式：η= c－－－ 1