PCR扩增相关技术基因与蛋白质工程课件.pptVIP

§2. PCR扩增及相关技术 I. PCR技术概论 一、PCR 历史回顾 由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基 因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时（1970年）Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。 直到1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）, 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。 其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。开始是使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热，因此，每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时，这一过程耗时，费力， 且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus公司推 出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖。 二、 PCR技术的基本原理 PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括3个基本步骤：(1). 变性(denature):目的双链DNA在94℃下解链；(2). 退火(anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3). 延伸（extension)：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这3个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板, 所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。 PCR原理图 三、标准的PCR反应体系 　　10×扩增缓冲液 　 10ul　　　4种dNTP混合物 　各200umol/L　　　引物 　　　　 　 各10～100pmol　　　　模板DNA 　　　 　0.1～2ug　　 　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　加双或三蒸水至 　100ul PCR反应五要素(参加PCR反应的五种主要物 质): 引物、模板、酶、dNTPs 和 Mg2+ 1、引物设计原则 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键.引物设计和选择目的DNA序列区域应遵循下列 原则： ①、 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。太 短会降低退火温度影响引物与模板配对，从 而使非特异性增高；太长则比较浪费，且难 以合成。 ② 、引物扩增跨度：1kb之内是理想的扩增跨度， 2kb左右是有效的扩增跨度，而超过3kb 就无 法得到有效的扩增. 特定条件下可扩增长至 10kb的片段。 1、引物设计原则 ③、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3’ 端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤ 、引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不 配对而导致PCR失败。 1、引物设计原则 ⑥ 、引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物5端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 ⑦、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 1、引物设计原则 引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10-100pmol， 以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会 引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚 体的机会。 常用的引物设计软件： Oligo 6 ；Primer Premier ； Vector NTI Suit； Dnasis； Omiga； Dnastar 2、模板与酶 模板可以是DNA，也