实验十二 HA-I试验 禽类实验室诊断技术课件.pptVIP

鸡新城疫抗体的检测（HA-HI实验） 一、实验目的 1、掌握HA实验和HI实验和操作方法。 2、掌握病毒凝集价（抗原效价）和凝集抑制价的判断。 二、实验原理 某些病毒表面含有血凝素，能与鸡红细胞表面的粘蛋白受体结合，使红细胞发生凝集，称为病毒的红细胞凝集现象，简称血凝现象。病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制，称病毒的红细胞凝集抑制现象（HI），简称血凝抑制现象。 通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 能凝集红细胞病毒：新城疫、禽流感及减蛋综合征病毒。 三、在生产中的应用 1、检测血清中的抗体水平，根据抗体效价的水平确定免疫时机。 2、免疫后及时监测，确认免疫效果。 3、辅助诊断病毒性疾病 病毒凝集红细胞的特性能被对应的抗体抑制。 四、实验材料（以新城疫抗体效价检测为例） 仪器：96孔V型微量反应板、振荡器 1台（振荡96孔V型板） 、微量移液器等。 材料：新城疫浓缩抗原、1%的鸡红细胞悬液、生理盐水、待检鸡的血清。 1%红细胞悬液制备 1、抗凝血的制备 采集3只非免疫成年健康鸡血液，由翅静脉或心脏采血，按3.8%柠檬酸钠与血液1：4混合制成。 2、1%红细胞悬液制备 将抗凝血加入离心管内，经2000r/min离心5min ，用吸管吸去血浆和白细胞。将沉淀的红细胞加生理盐水洗涤，再离心5min，弃去上清液，再用生理盐水洗涤。最后一次离心时间为10min，离心结束后，弃去上清液，根据剩下的红细胞体积，用生理盐水配制成1%红细胞悬液。 五、实验方法与步骤 1、加稀释液。用微量移液器向反应板的第1~12孔各加生理盐水50微升。 2、倍比稀释抗原。首先用灭菌的生理盐水将鸡新城疫浓缩抗原作5倍稀释。然后用微量移液器吸取5倍稀释的抗原50微升于第一孔中，并反复吹打4-5次，混匀后吸出50微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，从第11孔吸出50微升弃去；第12孔不加抗原作为红细胞对照。 （一）血凝实验（HA) 抗原稀释倍数 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 抗原稀释倍数 21 22 23 24 25 26 27 28 29 210 211 对照 3、加1%的鸡红细胞悬液。用微量移液器向1-12孔各加1%红细胞悬液50微升。 4、置于微量振荡器上，振荡1分钟。 5、室温静置15-20分钟后观察结果。 6、结果观察： 方法1：从平面观察，红细胞为一小圆点沉于孔底者，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，说明红细胞被病毒所凝集。如下图 方法2：将反应板倾斜45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。如下图 7、判定结果 （1）病毒凝集价（抗原效价）的判断：能使鸡红细胞完全凝集的病毒最大稀释倍数，称为该病毒凝集效价，以2的指数表示。 病毒凝集价为28 2、 4单位抗原的配制 凝集价稀释倍数中所含病毒量为1个凝集单位的病毒。凝集价前面第二孔所含病毒量为4单位病毒。 抗原应稀释的倍数=血凝滴度/4 例：上图抗原效价为28，也就是说在第8孔中病毒的含量为1个凝集单位，那么第6孔中病毒的含量为4个凝集单位。则4单位抗原应将原抗原作26（64）倍稀释。即取0.1毫升抗原，加入6.3毫升生理盐水。 五、实验方法与步骤 1、加稀释液 用微量移液器向反应板的第1~12孔各加生理盐水25微升。 2、倍比稀释被检血清 用微量移液器吸取待测血清液25微升于第一孔中并反复吹打4~5次，混匀后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25微升；12孔不加血清作抗原对照。 （二）血凝抑制实验（HI) 血清稀释倍数 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 血清稀释倍数 21 22 23 24 25 26 27 28 29 210 211 对照 3、加4单位抗原 1~12孔各加25微升。 4、置于振荡器上，振荡1分钟，室温静置 20分钟。 5、加1%的鸡红细胞悬液 用微量移液器向1~12孔各加1%红细胞悬液25微升。 6、置于振荡器上，振荡1分钟。室温静置20~25分钟后观察结果。 7、结果观察： 平面观察结果 反应板倾斜45度角观察 8、判定结果 （1）血清抗体效价的判断：能够使4单位病毒凝集鸡红细胞的作用完全被抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的抗体效价，以2的指数表示。 上图，血清抗体效价依次为28、 27、28、29、28、27、27、26 孔号： 1