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分光光度法 光度法主要内容 基本原理 定量依据（掌握） 仪器及结构（掌握） 测定条件选择 定量方法及仪器使用（掌握） 分光光度计 一、基本原理 一、基本原理（续） 二、定量依据 2、透光率T% 3、吸光度的测量要用参比液（掌握） 4、偏离朗白-比耳定律的原因 （三）分光光度计 （三）分光光度计 3、吸收池（又叫比色皿） 3、吸收池（续） 4、检测系统： 四、显色反应及条件的选择 3、测量条件的选择： 五、定量方法： 五、定量方法（续上篇） 六、回归与相关分析（见实训篇P26） 六、回归与相关分析（续） 2、相关系数r 3、标准曲线绘制过程（见实训篇P28）： 3、标准曲线绘制过程（续）： 721仪器使用 722仪器使用 谢谢！再见！ * * * * 1、光的基础知识： （1）基本性质： 波动性：如光的折射、衍射、干涉现象微粒性：如光的吸收、反射 （2）光的分类：根据波长不同，光可分为以下几个区： ? ——10nm————400nm————780nm————30um—— 紫外光区 可见光区 红外光区 （3）单色光和复合光： 单色光：只有单一波长光组成的光； 复合光：由两种或两种以上波长光组成的光。 2、物质对光的选择性吸收 （2）对不同有色物质，其λmax不同，吸收曲线形状也不同。 实验：使不同波长的光透过某一固定浓度C和同一液层厚度b的均匀有色溶液，测量此溶液对每一波长光λ的吸收程度A。 然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，所得曲线称为吸收曲线。 两点结论： （1）对同一有色物质，不论其浓度大小，其最大吸收处对应的波长λmax不变，A随浓度增大而增大； 应用：在分光光度法中，选择λmax为入射光波长。 描述了有色物质对 不同波长光的吸收能力 λ A 吸收曲线： 灵敏度高 稳定性好 表达式：A=lg(I0/I透)=abc 式中： I0——入射光强度 I透 ——透射光强度 A——吸光度 c——有色溶液的浓度，mol/L； b——吸收池液层厚度，cm。 a——比例常数，称为吸光系数。 物理意义： 当一束平行单色光通过均匀的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。 反映物质对光 吸收能力的大小 1、郎白-比耳定律： T范围：0～100%（15%～65%） A范围：∞～０（最佳范围：0.1～0.7） 则： T与A之间的关系： T=（ I透/ I0 ）× 100% 消除方法： 采用光学性质相同、厚度相同的比色皿盛上纯试剂作参比，调节仪器，使透过参比皿的吸光度A=0 原因： 为消除比色皿的反射和试剂吸收对光强度的影响，使光强度的减弱仅与溶液中待测物质的浓度有关。 ⑴非单色光引起的偏离 朗白-比耳定律适用于理想溶液。 消除措施:将溶液稀释到一定程度。 消除措施: 入射光选择被测溶液吸收曲线较平直部分(高峰处)对应的波长。 ⑵溶液浓度偏大 仪器基本组成： 光源、单色器、吸收池、读数检测系统 722S型 752型 可见分光光度计： 721型、722型、7220、722S、723、7230等 紫外-可见分光光度计： 751、752型等 ①具有足够的光强度； ②光强在一定时间内保持稳定。 （稳压装置） 棱镜材质： a、玻璃的：用于可见光区； b、石英的：适用于紫外光区。 1、光源： 作用：提供波长连续的复合光光 对光源的要求： 2、单色器： 作用：把复合光转变为单色光。 以棱镜、光栅作为单色器 可见光度计：玻璃材质紫外光度计：石英材质 比色皿架中的比色皿 比色皿 （1）手拿毛面； （2）装2/3满，事前润洗2~3遍； （3）用镜头纸擦干外周水滴，使光面干净； （4）位置放正； （5）测完后及时倒掉，冲洗干净（洗涤方法见P22）； （6）保持比色皿的配套性 （如不清楚时，应事前检验其配套性，见实训篇P21） 使用时注意事项（见实训篇P22 ）： 光信号 → 电信号，通过数据转换，显示吸光度值。 作用： 常用的是光电管。 显色反应：待测物质+显色剂 → 有色物质 （1）灵敏度高； （2）选择性好； （3）显色剂的A→0； （3）生成物有足够的稳定时间。 （1）显色剂用量： （2）反应液酸度、温度： （3）反应时间： （以上各项加入量都是通过实验确定的） 1、显色反应的选择： 2、显色条件的选择： （1）入射光波长的选择： （2）参比液选择： 总原则：使