病毒RNA提取与纯化说明书.doc

QIAamp UltraSensTM Virus Handbook （用于从1ml悬液样品中高效纯化可滤性病毒RNA或DNA，2003年1月） 1 试剂盒（250份） 纯化柱 250 接收管 2ml 750 AC 缓冲液 230 ml AR* 缓冲液 90 ml AB 缓冲液(浓缩) 22 ml AW1* 缓冲液(浓缩) 95 ml AW2* 缓冲液(浓缩) 66 ml AVE 缓冲液 10×2 ml 蛋白酶K 6 ml Carrier RNA 5×310 μg 2 保存 2.1 纯化柱室温保存（15—25 ℃，以下室温保存均指该温度），保质期12个月 2.2干粉状Carrier RNA 可室温保存1年；而溶于AVE缓冲液时需要等分，可于-20℃保存1年 2.3 蛋白酶溶液可室温保存1年，但于2—8℃环境下可延长保存期 3 安全 3.1 衣着：合适的实验室外套、一次性医用手套、护目镜 3.2 注意事项 3.2.1 勿将漂白剂或酸溶液直接加入样品准备废液中，当AR缓冲液和AW1缓冲液含有的胍氢可酮和漂白剂结合时会产生高敏性的有害混合物 3.2.2 缓冲液AC、AB、AR、AW1和蛋白酶K均具潜在危险性，操作时需认真谨慎 3.2.3 所有实验步骤均需在室温（15—25℃）下进行；样品液可于2—8℃下保存6小时，在-20℃或-80℃下保存更长时间；同时，样品需先用内部控制物处理，以防核酸酶降解 3.2.4 纯化柱（防交叉污染） 3.2.4.1 加入样品液时勿弄湿柱子边缘 3.2.4.2 注意更换有屏障的无核酸酶枪头 3.2.4.3 防止用枪头触碰柱膜 3.2.4.4 稍离心除去盖上液滴 4、设备与试剂 4.1 乙醇（96—100%） 4.2 无菌、无核酸酶、有屏蔽的枪头 4.3 无核酸酶离心管（1.5ml和2ml） 4.4 一次性无粉手套 4.5 磷酸盐缓冲液（PBS,当样品样不足1ml时） 4.6 可调速微型离心机（250—1200×g） 4.7 振摇孵育器，可加热 4.8试剂准备 4.8.1 Carrier RNA 每管加入310μl缓冲液AVE，制成1μg/μl 溶液，-20℃保存（冻融不能超过3次），每样品最优Carrier RNA量为5.6μg 4.8.2 缓冲液AB 加入标明的乙醇体积（96—100%），翻转10次，使得溶液均质，室温保存 4.8.3 缓冲液AW1* 加入瓶上标明的乙醇体积（96—100%），室温保存 4.8.4 缓冲液AW2* 加入瓶上标明的乙醇体积（96—100%），室温保存 5、流程 5.1 1ml处理液 5.2 细胞溶解，目标物沉淀于缓冲液AC中 5.3 在缓冲液AR中重新悬浮，并用蛋白酶K除去蛋白 5.4 加入缓冲液AB，连接，清洗2遍，洗提获得RNA或DNA 6、实验操作步骤 6.1 准备 6.1.1 使样品液温度平衡至室温（15—25℃） 6.1.2 校核缓冲液AB、AW1、AW2、Carrier RNA等 6.1.3 使AR缓冲液温度平衡至60℃（水浴锅） 6.1.4 所有离心操作需在室温下进行 6.2 吸取1ml 样液至2ml 离心管中（管盖上不能有液体粘附，防污染） 若不足1ml，需用磷酸盐缓冲液补足，但样液体积应不少于200μl 6.3 吸取0.8ml 缓冲液AC至样液表面；吸取5.6μl Carrier RNA液体至管盖（6.1μl mix）勿将缓冲液AC和Carrier RNA事先混合，且需加入内部控制物，同时推荐与Carrier RNA混合加入（0.5μl + 5.6μl Carrier RNA），即6.1μl mix 6.4 盖上盖子，上下翻转3次，涡旋10秒 6.5 室温孵育10分钟（最多15分钟，不能更久） 6.6 离心3分钟（1200×g），移除表面液体，收集沉淀（轻弹使沉淀松散，确保盖上无碎物） 6.7 移入300μl 预热至60℃的缓冲液AR和20μl 蛋白酶K 为了减少移液步骤，可将缓冲液与蛋白酶K混合，若10份，即3.3ml预热缓冲液AR和220μl蛋白酶（多10%），漩涡10秒混合后，分装320μl至每管 6.8漩涡至微粒完全重新悬浮 每次漩涡两管（5—10秒），后漩涡另两管，反复循环3—5次（或更多），有助于蛋白消化 6.9 在振摇孵育器上孵育10分钟，40℃，最高混匀速度 10分钟已足够长，不允许延长时间 6.10 稍离心，除去盖上液滴 6.11 移入300μl 缓冲液AB，漩涡混匀，稍离心 6.12 小心移取700μl溶解物至纯化柱（装在一2ml收集管上），勿弄湿边缘，盖上盖子，离心1分钟（3000—5000×g） 6.13 将纯化柱装在新的2ml收集管上（试剂盒中提供），遗弃旧收集管；小心打开纯化柱