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生化试验课件实验十：凝胶层析分离血红蛋白和DNP-胰糜蛋白酶
实验十 凝胶柱层析分离血红 蛋白和DNP-胰糜蛋白酶 掌握凝胶层析的原理、熟练掌握实验操作。 3、加样与洗脱 4、凝胶的再生 * * 刘向华 南京医科大学 Nanjing medical university 生化与分子生物学系 Department of biochemistry and molecular biology 一、目的与要求： 二、原理： 凝胶层析法是指混合物随流动相，经过凝胶(固定相)层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。 血红蛋白, Hb MW 67,000 daltons Color? DNP-胰糜蛋白酶 MW 13,500 daltons DNP 2, 4-dinitrophenol (taking on yellow color) Red 葡聚糖凝胶（Sephadex-G50） 具有三维多孔网状结构 P19 Hb：凝胶颗粒间隙，流程短，先流出 DNP-胰糜蛋白酶： 出入凝胶网孔，流程长，后流出 Sephadex G-50的准备 装柱15~20cm 三、操作步骤： 1、洗净的层析柱保持垂直。 2、放蒸馏水，排沙芯下空气，留2ml水，关闭出口 3、加入搅拌均匀的SephadexG-50悬液，调节流速10滴/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至15cm。 注意：床面上要保持少许水，防止胶床露出液面。如胶面不平，可用玻棒轻轻的搅动，让凝胶自然沉降，使表面平整。 4、上留1--2cm的水，关闭出口。 1、加样：滴管将血样加入水下床面上，在柱内形成一薄层 2、洗脱：打开出口，保持流速10滴/min，使样品溶液渗入凝胶。注意不断轻轻的加入蒸馏水，保持凝胶床面不露出水面。 3、观察：血红蛋白和DNP-胰糜蛋白酶的分离。相对分子量为：67000和13500。 观察后，要不断的加水使有色溶液全部流出，为下次实验做准备。 四、结果及讨论： ★将看到的现象以图示的方法画到你的实验报告上。并分析实验结果。 ★ Sephadex G-50? 交联度与凝胶孔径的关系？ ★ 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 。加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。 *
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