荧光衍生试剂在高效液相色谱与电泳中的应用.pptVIP

展 望 分析化学中的有机试剂在分析化学中占有与分析仪器同等重要的地位，荧光衍生化试剂则是有机分析试剂的一类重要分支。 性能优良的荧光衍生化试剂可能将成为某些物质的高灵敏 高选择性分析的关键，荧光衍生试剂的开发与应用也正朝这个方向发展。 在实际工作中将可能遇到各种现有荧光衍生试剂所不能解决或不能很好解决的问题。 有必要根据实际工作的需要来开发研究新型的荧光衍生试剂 Thank You! 各位老师同学大家好，我的seminar 的题目是荧光衍生试剂在高效液相色谱和电泳中的应用。 目前在ＨＰＬＣ中以离线的柱前衍生法(简称柱前衍生法)与在线的柱后衍生法(简称柱后衍生法)使用居多。 柱前衍生化是应用最为广泛的一种衍生技术，自由性大，离线更利于优化反应条件 在色谱分离前，样品组分经过特定的化学反应，使之转变为荧光衍生物进而进行色谱分离测定，该方法的优点表现在以下几方面：(1)通常不考虑衍生化反应的动力学，直到衍生反应完全。(2)为了使衍生反应及衍生产率获得最佳效果，可以任意选定衍生化条件。(3)柱前衍生化反应的溶剂不必与分离时的流动相配伍。(4)衍生化的副产物可进行预处理以降低或消除其干扰。其主要缺点表现在：(1)柱前衍生化反应形成的副产物可能对色谱分离造成较大难度，有时严重影响衍生化反应的重复性。(2)衍生物的降解，反应溶剂的杂质组分造成大量干扰峰。 要求衍生试剂具有与被衍生物反应生成稳定共价键结合物 衍生的主要目的是提高检测灵敏度，所以衍生试剂必须含有可检测的基团，对于荧光衍生试剂，荧光 团就是衍生试剂分子母体，一个好的衍生试剂还要具备较好的溶解性，试剂本身或其衍生物应含有水溶性基团，-SO3H, -COOH, -OH,等及易成氢键的原子，如O,N 或基团，这样易于分离和不会“塞柱”。 根据不同的衍生反应方式，对衍生试剂要求也不同。 对于柱前1一种衍生物2较高的衍生产率3试剂用量少，避免试剂峰的干扰 对于柱后1试剂与被分析反应迅速2衍生试剂转化率高，过量少 高效液相色谱和电泳作为分析技术不像气相色谱那样，具有较灵敏的通用检测器如氢火焰离子化检测器，热导检测器和电子捕获检测器等。示差折光检测器虽然较为通用，可是检测灵敏度低，满足不了微量物质检测的需要 （mg/L），质谱对于HPLC和CE是一种灵敏和通用的检测器，但由于价格昂贵还不能普及。广泛采用的UV检测器（0.1 mg/L），可对某些含有生色团的化合物进行测定，虽然有一定的灵敏度，但检测限显得过高。荧光检测器比起紫外吸收检测器要灵敏得多，但要求被检测样品能被激发产生荧光，对于不发荧光或荧光较弱的样品灵敏度很低，甚至不能检测。为了扩大其在高效液相色谱和电泳中的应用范围，提高检测灵敏度和改善分离效果，采用化学衍生法是一个行之有效的途径。 邻苯二甲醛(OPA) 荧光素异硫氰酸酯（FITC) 芴代甲氧基酰氯(FMOC) 4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑 (NBD-Cl) 6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯(AQC) Opa FITC FMOC NBD AQC 蛋白质的快速及有效的分离和高灵敏检测，仍然是目前研究的热点。 OPA He-Cd 激光光源 325 456 nm 10-9 mol/L 室温 30 min FITC Ar+ 488 nm 514 nm 25 度 3.5 h NBD-F Ar+ 488 nm 520 nm 50 度 5 min FQ 488 NM 10 min 这是浙江大学化学系微分析系统研究所集成化微流控芯片氨基酸分析仪 其中用到的荧光衍生试剂为 FITC，主要特点是试剂的最大激发波长与Ar+激光诱导荧光检测器相匹配 488 nm 芯片毛细管电泳分离多种FITC衍生的氨基酸 高等学校化学学报 2004, 25: 189~190 浙江大学化学系微分析系统研究所 方群 方肇伦 AQC 250 395 nm 在水溶液中，对于醇没有选择性的衍生试剂特别是在具有较大亲核反应活性的胺和硫醇反应的试剂可以用来衍生醇。 1-乙氧基-4-(二氯-S-三嗪)萘（EDTN) 手性衍生试剂除了具有一般荧光衍生试剂所备的反应基团和荧光基团外，必须是旋光的 另外，。 化学衍生法将对映体转化成一对非对映体 进而在普通非手性柱上分离 7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃 4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素 (ADMC) 9-蒽重氮甲烷 采用一种新型紫外、荧光衍生试剂9-(2-羟乙基)-吖啶酮（HEA），在缩合剂1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳酰二亚胺(EDC)及碱性催化剂4-二甲胺基吡啶(DMAP)的存在下，对10种胆汁酸进行柱前衍生，并通过荧光检测的方法进行高效液相色谱(HPLC)分析。 另外，采用各种手性硫醇和OPA衍生分离手性氨基酸研究也较多